部分结扎颈总动脉诱导ApoE基因敲除大鼠动脉粥样硬化模型及mTOR的相关性分析

发布时间：2017-07-03 02:06

  本文关键词：部分结扎颈总动脉诱导ApoE基因敲除大鼠动脉粥样硬化模型及mTOR的相关性分析

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【摘要】：研究背景和目的:目前,ApoE~(-/-)小鼠是已成功建立的较好的研究动脉粥样硬化的模型动物,然而其牵涉各动脉分支的动脉粥样硬化斑块分布以及斑块内组成成分与动脉粥样硬化病人有很大程度的不同。并且,考虑到其较小的体型,并不适合血管内成形术、试验新型药物支架或者新型医疗装置。虽然类如小型猪、犬类等大型动物当前也应用于血管移植方面的研究,但其价格也是不菲的。大鼠在研究心血管疾病方面,特别是高血压及脑卒中,是优秀而且适合的模型动物。相对于小鼠,大鼠的生理状况也更容易检测,也更类似于相应的人类情况,其大小也更适合血管内介入的操作。但目前为止,并没有适合动脉粥样硬化的大鼠模型。虽然前期不同的研究团队都尝试着用不同的诱导方法,去建立动脉粥样硬化模型,但这些结果仍然是不确定的。饮食诱导的高胆固醇血症并不能诱发大鼠的动脉粥样硬化,因此普遍认为大鼠具有对高脂的抵抗性,另一个可能的原因则为高脂诱导的高胆固醇血症,其血胆固醇水平仍不足以引起动脉粥样硬化。因此,我们尝试通过转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术,构建Apo E基因敲除大鼠,给予高胆固醇饮食,诱发其极高水平的高胆固醇血症,再采用部分结扎颈总动脉的手术方式造成紊乱的血流剪切力,导致血管内皮损伤,从而建立大鼠动脉粥样硬化模型并进行评价。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是调控平滑肌细胞增殖的关键分子,而近年来平滑肌细胞增殖被认为在动脉粥样硬化的发生和演变中均有重要作用,我们前期研究也发现mTOR的表达与小鼠动脉粥样硬化斑块的负荷具有相关性。因此,在本研究中拟进一步探讨冠心病患者外周血淋巴细胞mTOR的表达水平与冠脉狭窄程度的相关性。研究方法:研究分为两部分第一部分:ApoE~(-/-)大鼠动脉粥样硬化模型建立及评价1.实验动物及ApoE~(-/-)大鼠的构建雄性SD大鼠作为实验对照组,采用TALENs技术以SD大鼠为遗传背景构建Apo E敲除大鼠,所有实验动物均SPF环境培养,自由取食及饮水。2.高胆固醇饮食饲养将6-8周龄大小雄性SD野生型及ApoE~(-/-)大鼠随机分为普通饮食及高胆固醇饮食四组,高胆固醇饮食成分为67.8%基础饲料,10%猪油,1.5%胆固醇,0.5%胆酸钠,15%蛋黄粉,0.2%甲硫氧嘧啶,以及1.5%蔗糖。3.ApoE~(-/-)大鼠生理情况测量经过普通及高胆固醇饮食饲养12周后,测量每组体重、随机血糖、心率、动脉血压。4.血脂及血清炎性因子的测量检测其血清TG水平、TC水平、LDL-c水平、HDL-c水平,ELISA检测其肿瘤坏死因子a、白介素1b、白介素6、白介素10水平。5.主动脉大体油红染色6.部分结扎左侧颈总动脉将6-8周龄大小雄性WT及ApoE~(-/-)大鼠经过高胆固醇饮食处理10周后,部分结扎左侧颈总动脉,右侧颈总动脉作为对照,继续高胆固醇饮食两周后取材。7.组织病理分析主动脉根部及双侧颈总动脉进行油红O染色、HE染色、MASSON染色,双侧颈总动脉进行免疫荧光染色(CD31、CD68、a-SMA),以及TUNEL染色。8.实时荧光定量PCR1)检测主动脉MCP-1、VCAM-1的mRNA表达情况2)检测颈总动脉MCP-1、VCAM-1、mTOR的mRNA表达情况第二部分:外周血淋巴细胞mTOR mRNA水平与冠心病患者冠脉病变程度的相关性分析1.收集临床冠脉造影阳性及阴性结果患者病例资料2.检测外周血淋巴细胞mTOR mRNA表达情况3.进行相关临床指标及mTOR与冠状动脉病变程度的相关性分析结果:1.成功构建ApoE~(-/-)大鼠运用TALENs技术成功构建以SD大鼠为遗产背景的ApoE~(-/-)大鼠,基因组DNA测序结果显示其相对于野生型大鼠,于Apo E基因核心编码区缺失14个碱基对。2.ApoE~(-/-)大鼠生理情况普通饮食下ApoE~(-/-)大鼠和野生型大鼠体重无明显差异,但高胆固醇饮食喂养12周后,两种基因型大鼠体重均出现显著的降低(P0.05),而且高胆固醇饮食均造成ApoE~(-/-)大鼠与野生型大鼠随机血糖轻微的上升(P0.05)。ApoE~(-/-)大鼠相比野生型大鼠心率血压并无明显变化,说明Apo E基因缺陷并未对心率血压造成影响,但是高胆固醇饮食却导致了ApoE~(-/-)大鼠和野生型大鼠心率血压不同程度的下降(P0.05)。同既往的研究类似,高胆固醇饮食仅仅造成了野生型大鼠TG及LDL-c轻微幅度的升高(P0.01),但却促成了ApoE~(-/-)大鼠极其显著的上升(P0.01),形成了典型的血脂紊乱。3.ApoE~(-/-)大鼠对高胆固醇血症的抵抗性四组大鼠主动脉大体油红染色均呈阴性结果,同时,主动脉根部HE染色也未发现明显的动脉粥样硬化斑块形成。进一步探究原因,四组大鼠ELISA检测血清TNF-a、IL-1b、IL-6水平并没有明显的较大差异,实时荧光定量PCR结果显示高胆固醇饮食喂养的ApoE~(-/-)大鼠主动脉MCP-1、VCAM-1也仅仅是呈数倍的升高(P0.05)。4.部分结扎左侧颈总动脉诱导动脉粥样硬化高胆固醇饮食背景下,部分结扎左侧颈总动脉两周后的ApoE~(-/-)大鼠及野生型大鼠HE染色均显示出大小面积相似的斑块形成,MASSON染色结果均提示有少量纤维素沉积,但ORO染色结果显示ApoE~(-/-)大鼠斑块内阳性,而野生型大鼠则为阴性。免疫荧光染色结果显示ApoE~(-/-)大鼠斑块内富集大量的CD68阳性巨噬细胞,相比之下,野生型大鼠斑块内则显示富集大量平滑肌细胞而无CD68阳性巨噬细胞,另外,ApoE~(-/-)大鼠斑块内有CD31阳性的新生血管出现,而野生型大鼠则未发现明显CD31阳性结果。实时荧光定量PCR结果显示,两种基因型大鼠与正常右侧颈总动脉相比,结扎侧的颈总动脉MCP-1、VCAM-1、mTOR均有显著升高(P0.01)。5.两组患者临床指标的比较冠状动脉病变组的年龄、BMI、TG、TC、LDL-c、Gensini积分与冠状动脉正常组相比差异有统计学意义(P0.05),而其他因素如性别、民族、心率、血压、空腹血糖、FFA、ALT、AST、Scr、BUN、UA、HDL-c、Apo A、Apo B、LPA则差异无明显统计学意义。6.各临床指标及mTOR mRNA水平及与冠脉狭窄程度的相关分析全部患者TG、TC、年龄及外周血淋巴细胞mTOR表达水平均与冠状动脉病变的Gensini积分成正相关,相关系数r分别为0.254、0.236、0.207、0.343,P值均0.01,而LDL、BMI则与冠脉狭窄程度无明显相关性。结论:ApoE~(-/-)大鼠可成为高胆固醇血症新型模型,通过部分结扎左侧颈总动脉可建立动脉粥样硬化模型,其mTOR表达水平显著升高,临床回归性研究可验证患者外周血淋巴细胞mTOR表达水平均与冠脉狭窄程度呈正相关。
【关键词】：TALENs ApoE~(-/-)大鼠 动脉粥样硬化 mTOR
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5;R-332
【目录】：

• 英文缩略语表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 ApoE~(-/-)大鼠动脉粥样硬化模型建立及评价16-48
• 2.1 实验材料16-20
• 2.2 实验方法20-28
• 2.3 结果28-44
• 2.4 讨论44-48
• 第三章 外周血淋巴细胞mTOR mRNA水平与冠心病患者冠脉病变程度的相关性分析48-55
• 3.1 实验材料48-49
• 3.2 实验方法49-52
• 3.3 结果52-54
• 3.4 讨论54-55
• 全文结论55-56
• 参考文献56-59
• 文献综述 基因工程动脉粥样硬化动物模型研究进展59-66
• 参考文献63-66
• 攻读硕士学位期间发表的论文66-67
• 致谢67

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