人HVEM-Fc融合蛋白的制备及其生物学特性

发布时间：2017-07-17 13:24

  本文关键词：人HVEM-Fc融合蛋白的制备及其生物学特性

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【摘要】：为建立CHO/HVEM-Fc基因转染细胞株,使之能稳定分泌HVEM-Fc融合蛋白,采用常规PCR法分别从本单位已构建的重组载体pGEZ-Term/B7-H1-Fc和pIRES2-EGFP/HVEM上扩增人IgG1(Fc)恒定区和人HVEM胞外段编码基因,XhoⅠ和Bam HI双酶切人IgG1(Fc)恒定区及真核表达载体pIRES2-EGFP,将两种酶切的目的产物连接为pIRES2-EGFP/Fc,同时将获得的人HVEM胞外段基因片段经XhoⅠ和NheⅠ酶切后插入上述pIRES2-EGFP/Fc构建成pIRES2-EGFP/HVEM-Fc重组载体,通过脂质体转染仓鼠卵巢癌CHO细胞,培养基中添加G418长期筛选并将分泌目的蛋白的基因转染细胞株亚克隆化。流式细胞术检测HVEM-Fc融合蛋白的表达,收集含融合蛋白的基因转染细胞培养上清,Protein G亲和层析柱对其进行纯化,Western blot定性分析。MTT检测HVEM-Fc融合蛋白体外对抗人CD3单抗联合基因转染细胞L929/LIGHT刺激的T淋巴细胞增殖的影响。结果表明,基因转染细胞CHO/HVEM-Fc分泌的HVEM-Fc融合蛋白能与L929/LIGHT细胞有效结合,纯化后的蛋白经Western blot鉴定出现特异性清晰条带,并且HVEM-Fc融合蛋白对L929/LIGHT协同刺激的T细胞体外增殖具有抑制作用。
【作者单位】： 苏州大学附属第一医院江苏省临床免疫研究所;苏州大学基础医学与生物科学学院;苏州大学医学生物技术研究所;
【关键词】： 单纯疱疹病毒侵入介质(HVEM) 融合蛋白 共刺激分子 T细胞
【基金】：国家自然科学基金重点项目(30930085);国家自然科学基金(30600548) 苏州市科技发展计划(SYS201101) 江苏省青蓝工程人才基金
【分类号】：R392.12
【正文快照】： 适度、有效免疫应答的启动、发生、发展取决于正性和负性共刺激分子间的平衡[l，’」。作为TNF超家族成员之一的LIGHT与其受体分子HVEM结合可促进T细胞活化与增值〔，一5〕，而此正性信号的过度表达可诱发自身免疫疾病和移植时GVHD的发生，应用LIGHT抗体或其受体的融合蛋白阻

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本文编号：553809