2014年深圳市1型登革病毒流行株的分子溯源及全基因组序列分析

发布时间：2017-07-28 12:19

  本文关键词：2014年深圳市1型登革病毒流行株的分子溯源及全基因组序列分析

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【摘要】：一、背景登革热(dengue fever, DF)是由4种血清型的登革病毒(dengue virus, DENV1-4)引起的、经虫媒传播的一种急性传染病,其主要的传播媒介为白纹伊蚊及埃及伊蚊。登革热病毒感染蚊虫后,可在蚊子唾液腺中大量繁殖,通过叮咬人时将病毒传染给人。人感染任一血清型的登革病毒后,可表现为高热、头痛、肌肉和关节痛、皮疹、淋巴结肿大及白细胞减少等典型登革热的临床症状,甚至发展成为致死率很高的登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome, DSS) 。登革热广泛流行于全球热带及亚热带地区的100多个国家和地区,以东南亚和西太平洋地区的国家较为严重,如印度尼西亚、新加坡、泰国、越南、缅甸、印度、不丹、斯里兰卡、马尔代夫、孟加拉国等,其中以与我国接壤的东南亚国家的流行疫情最为严重,估计70%的人口面临感染登革病毒的风险,几乎每年都有登革热病例发生。近几十年来,登革热在全球的发病率明显上升,据世界卫生组织(WHO)统计,全世界40%以上的人口(约25亿)面临感染登革热及重症登革热(即登革出血热、登革休克综合征)的危险,每年全世界约有5000万～1亿新发登革热感染病例。2013年全球登革热发病估计值达到9600万例,较2012年增长了3倍。因此,监测与防控登革热已经成为一个国际公共卫生关切和亟待解决的问题。我国也是登革热的高发区,自1978年5月在广东省佛山市突然暴发登革热流行以来,几乎每年均有登革热病例报告(除外1983年、1984年和1996年)。登革热主要流行于广东、海南、广西、福建、台湾等南方及东南沿海省份,以广东省的登革热疫情最为严峻,登革病毒的4种血清型均有流行,进入21世纪以来,以登革1型病毒为主要的优势血清型。广东省的登革热表现为间断流行,有每隔4-7年发生1次流行的趋势,而且波及范围也越来越大。2002年、2006年两次较大范围流行以后,登革热的疫情获得了较好的控制,但2013年登革热在我国又出现了较大规模的流行,尤其是2014年全国再次暴发登革热大流行,发病人数及波及范围更是创近三十年以来的新高,疫情的严重程度已经引起高度关注。深圳市自成立经济特区以来,随着国内外交往和人口流动频繁,登革热发生和传播的机率大为增加。2001年报告了首例输入性登革热病例,之后不断有散在输入性病例报告,其中东南亚疫情的加重对深圳市登革热防制构成较大的威胁,深圳市连续几年的境外输入登革热病例来源均来源于东南亚或者其他热带国家。2010年深圳市福田区某建筑工地发生了十多例登革热疑似病例,经确诊为DENV-1病毒感染所致,阳帆[9]等人在分析此次登革热疫情暴发病因时,推测该起登革热疫情可能由本地登革1型病毒感染所引起,深圳可能存在登革1型病毒的疫源地,,但有待进一步探究。2011年深圳市健康人群登革热抗体水平调查也显示,健康人群登革热隐性感染较常见。2014年9月至12月,深圳市暴发了至今流行规模最大的登革热疫情,全市共报道确诊病例数454例,其中宝安区、福田区是本次疫情的重灾区。本次流行的一大特点是本地区感染病例较往年明显增加,且本地感染病例报告的时间要比2013年早,2013年的首例本地感染登革热病例时间为10月下旬,而2014年较2013年提前了1个多月。深圳位于广东南海之滨,且以外来人口为主；深圳属亚热带海洋性气候,平均气候22℃,雨量充沛,适于蚊虫滋生。因此深圳市2014年登革热疫情的暴发流行是否由本地感染引起的,即之前的登革病毒可能通过“伊蚊-人-伊蚊”的乡村型循环与隐性感染者的流动形成的城市型循环模式得以保存,并在适当条件引起2014年登革热疫情的暴发,这一结论有待进一步研究。二、研究对象深圳市宝安区人民医院2014年9-12月期间收治的登革热病例。三、研究目的对2014年9-12月深圳市登革热流行病毒株进行血清型别鉴定,了解此次登革热病原学的血清型情况；对细胞培养分离获得的登革病毒株E基因及全基因组序列,进行同源性比较和进化树分析,从分子水平上探讨2014年深圳登革病毒流行株的生物学特征,探讨其可能的来源。四、研究方法1.收集确诊登革热患者的病例资料,包括流行病学资料、临床表现、实验室检查,其中登革热病毒的血清学和核酸检测由深圳市疾控中心(CDC)完成。2.提取患者急性期血清标本中登革病毒RNA,逆转录为cDNAc经通用引物及型特异性引物二轮PCR扩增后,根据产物分子量大小确定登革病毒血清型。3.用BHK-21细胞培养分离6例1型登革病毒感染患者的急性期血清中的登革病毒。4.用Primer 3.0及DNAMAN软件设计2对1型登革病毒的E基因扩增测序引物,RT-PCR扩增6株深圳1型登革病毒全长E基因,产物经测序、拼接后,进行同源性与进化树分析。5.使用PCR DESIGN及DNAMAN软件,设计11对PCR引物,RT-PCR扩增2株1型登革病毒株全基因组序列,并对测序结果进行信息学分析。五、研究结果1.共35例患者确诊为登革热病例,本地流行病例占80.0%,而输入性病例仅占20.0%。2.21例患者经RT-nPCR检测阳性,产物经琼脂糖凝胶电泳分析后,20例出现大小为482bp的登革病毒型特异性片段,判定系登革1型病毒感染者,仅1例出现大小为119bp的登革2型病毒型特异性片段。前者本地感染及输入性感染病例数分别为16例(80.0%)和4(20.0%),后者为输入性病例。3.用BHK-21细胞培养分离PCR阳性的6名登革1型病毒患者急性期血清标本中的登革病毒株,6份标本均出现细胞肿胀变圆、空泡结构等细胞病变效应。4.6株深圳1型登革病毒株感染患者经E基因扩增、测序,全长均为1485bp,编码495个氨基酸。6株深圳登革1型病毒分离株同源性为100.0%,其同源性与深圳2010流行株接近,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.5%、99.8%,与新加坡2009和日本2004流行株的核苷酸和氨基酸同源性最高达99.7%、100.0%。进化分析发现,深圳6株登革1型病毒均属于基因型Ⅰ型,与Shenzhen2010、Singpore2029、Japan2004的亲缘关系较近,均在同一进化支上。5.对从2例患者分离的DENV-1株进行全基因组测序,结果显示2株深圳DENV-1同源性为100.0%。深圳登革1型病毒株全长均为10735bp,编码3329个氨基酸；全基因组序列进化分析表明此病毒株为基因亚型Ⅰ毒株,与东南亚的病毒株同源性最高。与我国登革1型病毒基因亚型Ⅰ毒株GZ/80相比,深圳2014年登革1型病毒株发生了碱基变异430个,氨基酸变异42个,5'非编码区(UTR)存在1处碱基差异,形成的二级结构相同,均形成7个茎-环结构,3’UTR序列共有8处位点发生变异,前者形成了21个茎-环结构,而后者形成了24个茎-环结构。六、结论1.2014年深圳以登革1型病毒流行为主,基因亚型属Ⅰ型,且主要是本地流行；2.2014年流行于深圳市的登革1型病毒分离株,无论从E基因进化树还是全基因组序列进化树分析,均与新加坡、马来西亚等东南亚分离株同源度最高,提示此次深圳流行的登革1型病毒可能来源于东南亚一带；3.2014年6株深圳登革1型病毒分离株与2010年深圳登革1型病毒本地分离株比较发现,二者高度同源且进化距离相当接近,传播链仅时隔4年,提示此次流行的登革1型病毒与2010年流行株关系密切,并且深圳也存在登革热流行的自然与社会因素,因此我们推测2010年流行株本地化并引起2014年登革热流行的可能性,深圳有可能存在1型登革病毒疫源地；4.2014年深圳登革1型病毒分离株与GZ/80毒株存在一定的变异,二者属于同一个基因亚型。
【关键词】：登革热 登革1型病毒 血清型 基因亚型 进化树 序列分析
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-18
• 第一章 2014年深圳登革病毒流行株血清型别鉴定18-33
• 第一节 材料18
• 第二节 方法18-23
• 第三节 结果23-27
• 第四节 讨论27-32
• 第五节 结论32-33
• 第二章 2014年深圳市DENV-1流行株E基因型特征及分子溯源研究33-47
• 第一节 材料33-34
• 第二节 方法34-38
• 第三节 结果38-43
• 第四节 讨论43-46
• 第五节 结论46-47
• 第三章 2014年深圳市DENV-1流行株全基因组序列分析47-62
• 第一节 材料47
• 第二节 方法47-50
• 第三节 结果50-58
• 第四节 讨论58-61
• 第五节 结论61-62
• 参考文献62-67
• 附录67-89
• 中英文对照缩略词表89-91
• 攻读学位期间成果91-92
• 致谢92-94

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本文编号：584014