酵母相马尔尼菲青霉黑素的生成和TYR基因的关系及次级代谢产物的研究

发布时间：2017-07-29 01:03

  本文关键词：酵母相马尔尼菲青霉黑素的生成和TYR基因的关系及次级代谢产物的研究

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【摘要】：目的(1)探索LDOPA对酵母相马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei,PM)的作用,从观察培养基的颜色、菌落形态和颜色、光学显微镜下形态和荧光定量PCR仪检测目的基因酪氨酸酶基因(TYR)表达的角度初步探讨不同培养基在有或无L-DOPA对酵母相马尔尼菲青霉的作用。(2)建立同时测定黄曲霉素、胶霉素、交沙霉素3种有效成分的量的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析方法及检测酵母相马尔尼菲青霉(PM)能否产生如黄曲霉素、胶霉素、交沙霉素等次级代谢产物。方法(1)将2株马尔尼菲青霉菌株分别在含和不含1.0 mM L-DOPA的沙氏培养基、脑心浸汁培养基(BHI)以及含10%的胎牛血清的高糖固体培养基(DMEM)进行酵母相避光培养3天,观察菌落、培养基颜色及镜下观察形态学的变化以及荧光定量PCR测定酪氨酸酶基因(TYR)的表达。(2)采用Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 (2.1×50mm,1.8μm)色谱柱；选择含甲醇(A)-0.1%甲酸的水(B)为流动相,体积流量为0.3mI/ min。在电喷雾电离正离子模式下采用MRM检测。将PM标准株FRR和临床人分离株GXMUDXR分别在含10%的胎牛血清的高糖液体培养基进行酵母相培养7天,经前处理后检测黄曲霉素、胶霉素、交沙霉素这三种有效成分。结果(1)2株受试菌株在沙氏固体培养基中37。C避光培养3天,含L-DOPA和不含L-DOPA的PM菌株菌落颜色均无明显改变；(2)2株受试菌株在脑心浸膏培养基(BHI)上37。C避光培养3天,不含L-DOPA培养基上的菌落较含L-DOPA培养基的菌落颜色浅；(3)2株受试菌株在含10%胎牛血清高糖固体培养基上37。C避光培养3天,不含L-DOPA培养基上的菌落颜色浅,而含L-DOPA培养基上的菌落颜色变黑,且含L-DOPA不含PM菌株的培养基颜色也变黑；(4)光学显微镜下观察结果：2株受试菌株在沙氏培养基、含和不含L-DOPA的BHI培养基、含和不含L-DOPA的10%胎牛血清的DMEM上37。C培养3天后,各个培养基上的PM酵母细胞的形态、大小基本一致,均未见到被染成黑色；(5)荧光定量PCR检测酪氨酸酶基因的表达：a.BHI培养基组：含和不含L-DOPA的竹鼠分离株PM及临床人分离株PM中TYR基因的表达量均高于同组沙氏培养基组,差异有统计学意义(P0.05)；且同组中含L-DOPA的BHI组中TYR的表达量高于不含L-DOPA的BHI组,差异有统计学意义(P0.05)。b.含10%胎牛血清的DMEM组：结果显示含和不含L-DOPA的标准株PM及临床株PM中TYR基因的表达量与同组沙氏培养基组相比,差异无统计学意义(P0.05)。且同组含和不含L-DOPA的10%胎牛血清的DMEM组相互比较,两者TYR的表达差异无统计学意义(P0.05)。(5)与标准品比较,酵母相马尔尼菲青霉菌未检测出与黄曲霉素、胶霉素类似的目标峰,但各个样品甚至是空白对照,均出现与交沙霉素类似的目标峰,但强度远远小于标准品。结论(1)PM菌株在含有L-DOPA的BHI培养基中可以利用L-DOPA产生黑色素。(2)在BHI培养基中添加外源L-DOPA能提高PM菌株酪氨酸酶基因的表达。(3)本实验未能检出马尔尼菲青霉菌中黄曲霉素、胶霉素、交沙霉素这三种次级代谢产物成分。
【关键词】：马尔尼菲青霉菌 L-DOPA TYR 次级代谢产物 UPLC-MS/MS
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R379
【目录】：

• 个人简历3-5
• 主要英文缩略词5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-14
• 第一部分 酵母相马尔尼菲青霉黑素的生成和TYR基因的关系14-39
• 材料和方法15-24
• 结果24-32
• 讨论32-38
• 小结38
• 展望38-39
• 第二部分 酵母相马尔尼菲青霉次级代谢产物的研究39-52
• 材料和方法40-43
• 结果43-47
• 讨论47-50
• 小结50-51
• 展望51-52
• 参考文献52-61
• 综述61-74
• 参考文献69-74
• 致谢74-75
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文75

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本文编号：586769