乙型肝炎病毒肿瘤蛋白细胞靶标HBXIP负向调控Toll样受体信号转导的机制研究

发布时间：2017-07-29 12:00

  本文关键词：乙型肝炎病毒肿瘤蛋白细胞靶标HBXIP负向调控Toll样受体信号转导的机制研究

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【摘要】：目的：研究HBXIP在LPS诱导的TLR4信号转导通路中发挥的作用；阐明HBXIP在TLR4转运和降解过程中的重要作用及其机制。方法：1.构建pcmv-mHBXIP真核表达质粒,并测序鉴定。2.定量PCR与Western blot的方法检测HBXIP的表达规律,分析LPS刺激下HBXIP的表达变化。3.以小鼠巨噬细胞系Raw264.7为细胞模型,建立HBXIP高表达和表达抑制的稳定转染细胞系,用定量PCR和Western blot的方法鉴定HBXIP高表达和表达抑制的稳定转染细胞系。4.用定量PCR和ELISA方法检HBXIP高表达的Raw264.7细胞系以及HBXIP表达抑制的Raw264.7细胞系中IL-6、IL-1β、TNF-β等炎症因子的表达情况；用Western blot的方法检测LPS诱导下NF-κB信号通路以及MAPKs信号通路的变化(包括KKα/β、IκBα、p65、JNK、Erk、p38、IRF3等)。5.通过免疫共沉淀的方法,检测HBXIP和TLR4的直接作用；通过FACS分析巨噬细胞表面TLR4的表达变化；通过Western blot的方法检测TLR4蛋白水平,用定量PCR检测TLR4的转录水平变化。6.通过Western blot的方法检测HBXIP高表达的Raw264.7细胞系以及HBXIP表达抑制的Raw264.7细胞系中LC3Ⅱ的表达情况以及mTOR信号通路的变化。7.采用流式细胞术分析HBXIP对巨噬细胞溶酶体数量以及溶酶体pH的影响。8.利用激光共聚焦,定位分析HBXIP高表达的Raw264.7细胞系以及HBXIP表达抑制的Raw264.7细胞系中TLR4与溶酶体以及自噬小体的共定位。9. Western blot方法检测HBXIP对巨噬细胞中转录因子EB (transcription factor EB, TEFB)的磷酸化水平的影响；利用激光共聚焦分析HBXIP对TFEB核转位的影响。10.电镜观察HBXIP高表达和表达抑制的稳定转染细胞系中溶酶体的形态。11.用TFEB siRNA, Rab7 siRNA, mTORCl的激动剂Cycloheximide(CHX),溶酶体活性抑制剂Chloroquine diphosphate (CQ),自噬溶酶体融合抑制剂Vinblastine处理巨噬细胞,Western blot方法检测HBXIP对TLR4蛋白水平的影响。结果：1. HBXIP在LPS的刺激下呈现时间依赖性。2. HBXIP能够使IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β等促炎因子的表达显著下调,HBXIP能减弱LPS诱导下NF-κB信号通路以及MAPKs信号通路的磷酸化。3. HBXIP对TLR4的蛋白水平有靶向调控作用,HBXIP过表达能够显著抑制TLR4的蛋白表达。4. HBXIP过表达能促进LC3Ⅱ的表达,抑制mTOR信号通路的相关蛋白的表达水平,促进细胞自噬。5. HBXIP过表达能减少TFEB的磷酸化水平,促进其核转位,从而影响溶酶体的数量和功能。过表达HBXIP后,再用自噬溶酶体相关抑制剂处理,HBXIP对TLR4的下调作用消失。结论：HBXIP通过促进转录因子TFEB的活化,提高了溶酶体以及自噬溶酶体的活性,促进TLR4的内吞和降解,抑制了LPS诱导的IL-6, IL-1β, TNF-α以及IFN-β炎症因子的分泌。我们认为HBXIP是一个新的TLR4信号转导的负向调控分子。
【关键词】：Toll样受体4 HBXIP 自噬溶酶体 转录因子EB
【学位授予单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373.21
【目录】：

• 致谢5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 缩略词表11-14
• 1. 绪论14-17
• 2. 材料和方法17-30
• 2.1 材料17-22
• 2.2 实验方法22-30
• 3. 实验结果30-53
• 3.1 mHBXIP的全长克隆30
• 3.2 HBXIP能被LPS诱导产生30-31
• 3.3 HBXIP调节TLR4信号转导的研究31-37
• 3.4 HBXIP抑制TLR4的表达37-39
• 3.5 HBXIP对自噬的影响39-41
• 3.6 HBXIP对溶酶体的影响41-47
• 3.7 HBXIP促进TLR4转移到自噬溶酶体47-53
• 4. 讨论53-56
• 参考文献56-60
• 综述60-74
• 参考文献68-74
• 作者简介74

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本文编号：589006