3D打印结构性微环境调控表皮细胞分化为汗腺的效应研究

发布时间：2017-08-01 22:27

  本文关键词：3D打印结构性微环境调控表皮细胞分化为汗腺的效应研究

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【摘要】：背景：皮肤中所生长的汗腺组织具有重要的分泌汗液、排泄废物的作用,对维持皮肤健康、机体体温平衡尤为关键。一旦汗腺组织遭到大面积的破坏便会导致机体大量汗液排出体外障碍,所造成的缺陷将严重地影响患者的生活质量。例如在炎热气候,体育锻炼或发热等情况下,如果汗腺功能失调可导致高体温,中风,甚至死亡。皮肤损伤(包括烧伤、战伤以及其它物理与化学等因素造成的损伤)也会导致汗腺功能受损,尽管目前我国烧伤早期救治处于国际领先水平,但令人遗憾的是存活患者皮肤多为瘢痕修复,皮肤附件如汗腺、毛囊以及皮脂腺等缺乏的问题尚待解决,因而并不能算是真正意义上的修复与再生。目前,基于小鼠汗腺模型的研究表明在足趾垫部分存在有助于创面修复的干细胞群。然而,这些汗腺细胞修复活动的分子机制以及在重度皮肤损伤累及汗腺的情况下还能否发挥其修复功能等问题上还是未知数。在这种创伤条件下,遭创区域的全层皮肤组织结构都已遭到破坏,汗腺组织的严重结构性毁损必将形成,依赖自身原位细胞的分裂、增殖与分化来实现复杂结构的重建显得尤为困难,而且有研究表明创面周边的正常汗腺细胞在创面修复过程中呈静息状态,因此很难使其自行趋化至创面修复已缺损汗腺的功能。汗腺的再生将有效地提高损伤修复过程中局部皮肤组织的环境适应能力,更重要的是最终能恢复患者正常的排汗功能。汗腺再生的纵深研究能够为提高创伤救治及愈合的质量提供更多强力的支撑,因此具有急迫的临床需求。汗腺和其他皮肤附件一样是由表皮前体细胞自胚胎期分化形成。然而,不同于已为人熟知的毛囊、皮脂腺等其他表皮衍生物,关于汗腺的研究十分有限。但目前可以确定的观点均认为表皮来源的干细胞／祖细胞仍是最具代表性且最有希望的再生汗腺种子细胞。然而多向分化潜能是表皮干(祖)细胞的突出特性,要实现其往汗腺定向分化需要构造出特定的微环境。不同组的研究结果共同发现,汗腺的萌发生长依赖于表皮的基底膜区生理性稳定以及真皮-表皮间的相互作用,其中汗腺生长周围的细胞外基质(ECM)是重要因素之一。ECM成分作为具有生物作用的功能活性区域,发挥与细胞的定向分化紧密关联的作用。ECM内容不仅能够引导内在细胞的表型发生改变,而且可通过自身动态的结构改建与活性改变来影响内在细胞的生物学行为及细胞命运。另外,许多种类的细胞因子或生长因子如表皮生长因子(EGF)、骨形成蛋白-4(BMP-4)等的作用都证实能够发挥生物学作用影响汗腺的发生与功能。我们所在的研究小组也在汗腺发育基因表达规律、汗腺主要标志物鉴别等方面进行了前期研究。现有结果表明,汗腺细胞的增殖、分化和汗腺形态发生受到多种信号分子、生长因子和ECM成分的调控。鉴于这些发现,汗腺发生区域真皮组分和生长因子是ECM中决定表皮祖细胞命运最为至关重要的因素。近年来,随着生物材料在组织工程和再生医学领域的普及应用,在体外建立适合干细胞生长并影响其生物学行为的微环境成为可能。在众多发展起来的及发展中的生物材料与组织工程新生技术中,3D生物打印技术因具有多方面的优势而获得重视并得到广泛应用。以往细胞生长在平坦表面形态的二维结构中会失去其在组织中的基本功能并表现出不同形态,而且细胞间、细胞与基质间的相互作用也与体内大不相同。而3D生物打印技术既能克服如此不足,弥补调控在空间上的缺陷,给细胞提供更多足够的活动空间,而且还有利于血管和神经的爬布生长,从而更好更完整地模拟出细胞的自然微环境(niche),进而促细胞增殖、分化。尤其突出的是,3D生物打印技术具有高精度和构建速度快的特点,不仅可以在三维层面确保不同种类细胞、细胞外基质和生物活性因子的位置和分布的准确性,而且异质的种子细胞和支架材料加入到同步的3D打印体系则能更利于整体三维结构的构建。尽管按照目前的技术水准及制作工艺,利用3D打印技术所构建出的三维组织结构仍较为简单,但3D生物打印技术在组织工程中应用的可行性已经足以现有的研究工作所证实,这一点在本人所在实验室小组的前期研究中已经得到证实。基于3D生物打印基础构建的天然材料基质复合生长因子以及真皮基质成分后,能够最大限度地模拟出诱导表皮来源的祖细胞定向分化为汗腺细胞的微环境,而移植于皮肤全层缺损的创面后能够促进皮肤创面的愈合,再生出汗腺组织。如通过设计将以上新技术进一步优化并合理应用于汗腺再生研究,有望真正实现汗腺再生治疗的临床转化,并为新时期下的再生医学研究提供更具有效性的以及个性化需求的创新策略。目的：该研究的目的和设计是建立基于3D生物打印平台的、具有诱导表皮祖细胞定向分化为汗腺细胞潜在能力的优化方案,并由此探讨其分化过程中打印结构对汗腺再生效果的影响和作用机制,使其更有利于实现向汗腺再生研究的临床转化。方法：1.表皮祖细胞培养和鉴定：首先从出生前12.5天(E12.5)雌性GFP-C57/B16小鼠(Jackson Laboratory)的背部皮肤中获取表皮干细胞,采用本研究小组所在实验室已较成熟的培养系统,对表皮祖(干)细胞进行培养扩增及鉴定。2.真皮基质成分获取：去除毛发后从野生C57/B16小鼠的足趾垫区(汗腺发生的微环境)获取真皮并制成真皮基质匀浆(PD),同时获取小鼠背侧真皮基质(非汗腺发生的微环境)匀浆作为对照(DD)。3.生物打印油墨(bioink)制备以及打印过程：通过3D生物打印机(Regenovo 3D生物打印机,中国)突出的3D快速成型技术,按照1：9的比例将1ml富集的表皮祖细胞悬液(1×107cell/ml)和真皮基质匀浆(1ml),加入到20%的明胶(12ml)和4%的海藻酸钠(6m1)的混合水凝胶中,将上述混合成分封装入事先消毒好的两种不同打印直径(300μm、400μm)的打印容器中按照设计的模型打印出多孔性三维结构体。打印样品用荧光显微镜进行原位的观察。4.细胞活性和生长因子释放活性检测：活细胞计数法原位分层检测体外培养1-14天过程中模型中细胞的增殖以及活性。已有研究证明,真皮基质成分中BMP-4的含量在表皮系细胞向汗腺分化过程中起重要调控作用。而在本研究中,随打印墨水中明胶成分的降解,诱导成分中BMP-4也会随之释放。因此,用HE染色法检测降解水平并用酶联免疫测定法(Elisa)法检测1-14天打印体所释放的BMP-4浓度。5.细胞定向分化能力检测：培养1-14天后检测模型固定并制成切片做免疫组化染色,检测细胞的表皮基底细胞角蛋白CK5,CK14和汗腺管腔细胞角蛋白CK18,CK19的蛋白表达水平。培养1-28天后观察打印体中的汗腺组织形成情况。结果：本研究建立的基于两种不同打印直径(300μm、400μm)打印喷头的多孔性打印体在孔径大小以及空间微结构上有所区别,但所有打印模型中各层均可保持细胞活力且细胞分布较为均匀,具有可重复性和均一性。复合PD组所打印的3D细胞外基质在细胞增殖、降解效果以及BMP-4释放等特性上无显著差异,且均可以诱导表皮祖细胞向汗腺分化。但是,与400μm组相比,300gm喷头复合PD组(300μmPD+)打印出的3D细胞外基质中细胞密度更高且在更短时间内出现了汗腺细胞标志物的强表达。更为显著的是,300μmPD+组是唯一能够观察到明显汗腺组织形态发生的打印模型,而其余组均未见明显汗腺组织形成。将已经分化的汗腺细胞或者形成的汗腺组织脱离开3D打印结构进行2D培养后则发现细胞分化终止或不再形成组织。结论：本研究立足于以发展成熟的应用基础学科(组织工程、生物材料)为基础,结合3D生物打印的创新技术平台,模拟构建使表皮干细胞能定向分化为汗腺的微环境模型,在时间空间点的可控性和直观性上为体外汗腺再生研究提供了良好基础；同时3D生物打印技术也优化了模型构建模式,使其比传统组织工程模式更具科学性和应用价值。此外,本研究是在对汗腺发生发育的基本规律和形态结构认识的基础上,依托3D生物打印技术实施完成的,前期研究的基础已经为探讨3D生物打印皮肤微环境对表皮干细胞的定向诱导分化的关键作用研究提供了可靠的证据。本研究也再次明确了表皮来源的成体干细胞可借由3D打印的特定微环境用有效的分化为汗腺细胞。更为重要的是,本研究结果充分证明了3D生物打印的多孔状结构对表皮祖细胞向汗腺的的分化乃至汗腺组织的形成具有实质性的作用,这不仅是为探索汗腺再生机理和功能重建提供了全新的研究策略,也为探讨3D打印的空间结构对细胞生物学特性的影响以及诱导组织再生的基础研究奠定了坚实的实验依据,同时优化的打印策略也为成体干细胞诱导汗腺再生的临床转化研究奠定了理论基础。
【关键词】：汗腺再生 干细胞 3D生物打印 组织工程
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R339.11
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第1章 研究背景16-26
• 1.1 汗腺再生研究的重要性16-17
• 1.2 汗腺再生的研究现状17-20
• 1.3 3D细胞外基质20-22
• 1.4 组织工程中的3D微结构制造22-24
• 1.5 本研究的意义24-26
• 第2章 材料与方法26-46
• 2.1 实验材料26-32
• 2.1.1 主要实验试剂26-28
• 2.1.2 主要实验仪器28-30
• 2.1.3 主要实验溶液的配制30-32
• 2.2 实验方法32-46
• 2.2.1 小鼠胚胎EP的提取及培养33-34
• 2.2.2 天然SGC分化诱导剂PD的制备34-35
• 2.2.3 实验分组及bioink的制备35-36
• 2.2.4 3D生物打印的流程36-40
• 2.2.5 细胞活力与增殖的测定40-41
• 2.2.6 HE染色及免疫荧光检测41-43
• 2.2.7 骨形态发生蛋白浓度测定43
• 2.2.8 小鼠汗腺细胞的提取、培养与鉴定43-45
• 2.2.9 数据分析45-46
• 第3章 结果46-56
• 3.1 3D打印体的特征46-47
• 3.2 3D多孔性打印体细胞活力及增殖47-48
• 3.2.1 打印体维持较高的细胞活力47
• 3.2.2 细胞于打印体中保持增殖能力47-48
• 3.3 3D多孔性打印体的降解及BMP4释放48-51
• 3.3.1 打印体的缓慢降解48-49
• 3.3.2 BMP4的稳定释放49-51
• 3.4 3D多孔性打印体的汗腺细胞分化51-54
• 3.5 3D多孔性打印体中典型汗腺样组织的形成54-56
• 第4章 讨论56-58
• 第5章 结论58-59
• 参考文献59-65
• 攻读硕士学位期间的研究成果65-66
• 中英文符号对照说明表66-68
• 致谢68-69

【参考文献】

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1 ;Morphological and distribution characteristics of sweat glands in hypertrophic scar and their possible effects on sweat gland regeneration[J];Chinese Medical Journal;2005年03期

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本文编号：606521