溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统“针状样”毒力装置相关基因功能的研究

发布时间：2017-08-04 17:01

  本文关键词：溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统“针状样”毒力装置相关基因功能的研究

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【摘要】：溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)III型分泌系统的“针状样”毒力装置(Needle-like injectisome)又称为注射小体,是III型分泌系统中一个复杂的微型装置,负责将效应蛋白传输到真核细胞。注射装置从细菌细胞质基质向外伸出内中空的针到达宿主细胞表面,该注射过程一共横跨三层膜。本研究成功克隆并分析了注射装置上两个重要因子:vscP基因和vscX基因。vscP基因ORF为1206 bp,共编码401个氨基酸残基,分子质量约为44.4 kD,等电点为5.72。构建VscP亚基三维结构模型发现,其与鞭毛FilK蛋白有相似构型。vscX基因ORF为378 bp,共编码125个氨基酸残基,分子质量约为14.2 kD,等电点为5.75。网络互作分析结果显示vscX与vsc Y、vopB、sycN等有相邻的关系。VscP和VscX各自具有一个重要结构域,分别是T3S4(369-389aa)结构域和Pfam(1-125aa)结构域。运用实时荧光定量PCR技术,结合2-△△Ct法分析VscP和VscX在分别在溶藻弧菌野生株HY9901、III型分泌系统护航蛋白缺失株△vscO和互补株C-vscO菌株中不同生长时期的mRNA表达差异。结果显示,VscP和VscX的mRNA表达量均随溶藻弧菌HY9901生长而增长,在生长平缓期显著上调(p0.01)。在vscO基因缺失后,VscP和VscX的mRNA表达量均在生长晚期显著上调(p0.01),说明vscO的缺失破坏了VscO与VscP、VscX之间的协同关系,使得VscP和VscX在生长晚期表达过剩。选取VscP抗原制备亚单位疫苗,首先构建重组质粒pGEX-vscP,并转化到大肠杆菌中表达;然后以28℃,0.4 mM IPTG,5 h的最优条件培养获得重组蛋白,并用GST标签的纯化柱纯化;最后,VscP抗原免疫多鳞淶(Sillago sihama Forskál),溶藻弧菌、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)攻毒两周后,VscP抗原对多鳞淶的相对免疫保护率分别为67.7%、86.6%,说明VscP抗原有望成为制备具有交叉保护作用的亚单位疫苗的良好材料。首次应用蛋白质组学方法研究VscP蛋白免疫多鳞淶后其脾脏蛋白的表达差异,应用双向凝胶电泳技术和质谱分析技术对蛋白进行分离鉴定,结果表明,VscP蛋白免疫组所得蛋白点为1316个,免疫前对照组所得蛋白点为1149个,PBS对照组所得蛋白点为1291个,PBS+佐剂对照组所得蛋白点为1316个。与对照组相比,在免疫组发现9个差异蛋白,5个为上调表达的蛋白和4个为新增蛋白,为进一步研究其免疫保护机制奠定基础。
【关键词】：溶藻弧菌 vscP vscX III型分泌系统 免疫保护 蛋白质组
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1 文献综述9-19
• 1.1 海水养殖中的弧菌9-10
• 1.1.1 溶藻弧菌9-10
• 1.1.2 哈维氏弧菌10
• 1.2 III型分泌系统10-14
• 1.2.1 T3SS“针状样”装置的结构11
• 1.2.2 T3SS的侵染11-14
• 1.3 弧菌的病害防治14-15
• 1.4 蛋白质组学在海洋生物中的研究进展15-17
• 1.5 技术路线17-18
• 1.6 研究目的及意义18-19
• 2 溶藻弧菌vscP和vscX基因的克隆和荧光定量PCR19-37
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 菌株与质粒19
• 2.1.2 主要试剂和实验仪器19-21
• 2.2 方法21-24
• 2.2.1 细菌总DNA的提取21
• 2.2.2 vscP和vscX基因的克隆21
• 2.2.3 目的片段的连接，转化和测序21-22
• 2.2.4 生物信息学分析22
• 2.2.5 荧光定量PCR22-24
• 2.3 结果24-34
• 2.3.1 vscP基因的克隆分析24-30
• 2.3.2 vscX基因的克隆分析30-34
• 2.3.3 RT-PCR34
• 2.4 讨论34-37
• 3 溶藻弧菌VscP蛋白的免疫原性和免疫保护性分析37-47
• 3.1 实验材料37-38
• 3.1.1 菌株与质粒载体37
• 3.1.2 实验仪器37-38
• 3.1.3 主要实验试剂38
• 3.1.4 实验鱼体38
• 3.2 方法38-41
• 3.2.1 原核表达载体的构建38-39
• 3.2.2 VscP蛋白表达条件的优化39
• 3.2.3 VscP蛋白的纯化与定量39-40
• 3.2.4 VscP蛋白对多鳞淶的免疫保护率40-41
• 3.3 实验结果与分析41-45
• 3.3.1 vscP基因的原核表达41-44
• 3.3.2 VscP蛋白对多鳞淶的免疫保护性分析44-45
• 3.4 讨论45-47
• 4 Vsc P蛋白免疫多鳞淶脾脏蛋白质组学初步分析47-54
• 4.1 实验材料47
• 4.1.1 主要仪器47
• 4.1.2 主要试剂47
• 4.2 实验方法47-49
• 4.2.1 蛋白质样品制备47-48
• 4.2.2 蛋白质的纯化与定量48
• 4.2.3 双向电泳48-49
• 4.3 结果49-52
• 4.3.1 对照组与免疫组脾脏SDS-PAGE比较49
• 4.3.2 VscP免疫多鳞淶脾脏蛋白的 2-DE图谱49-52
• 4.4 讨论52-54
• 5 结论54-55
• 5.1 溶藻弧菌T3SS“针状样”毒力装置相关基因的克隆和生物信息学分析54
• 5.2 溶藻弧菌T3SS“分子尺”VscP蛋白的表达和免疫保护54
• 5.3 VscP蛋白免疫多鳞淶脾脏蛋白质组学初步分析54-55
• 参考文献55-63
• 致谢63-64
• 作者简历64-65
• 导师简介65

【参考文献】

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本文编号：620669