葡萄糖和O-GlcNAc糖基化对hBMSCs的影响

发布时间：2017-08-05 05:14

  本文关键词：葡萄糖和O-GlcNAc糖基化对hBMSCs的影响

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【摘要】：一、研究背景人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)因其较强的增殖能力和潜在的分化多能性在组织工程再生医学领域有着广阔的发展前景。然而当前体外培养中发现,部分hBMSCs会出现增殖缓慢、过早凋亡、衰老甚至分化抑制等问题,严重影响其作为种子细胞的运用,而hBMSCs外培养的微环境则在其中扮演着重要的角色。葡萄糖作为生命的核心能量来源和重要代谢产物,体内外微环境中葡萄糖显著影响着细胞的增殖、凋亡、衰老和分化。氨基己糖合成通路(HBP)是细胞营养状态的感应器,微环境中葡萄糖浓度变化可以通过HBP影响细胞内蛋白质的O-GlcNAc糖基化水平。O-GlcNAc糖基化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,众多细胞核、细胞质和线粒体蛋白质都可以被其修饰,在细胞生命活动中发挥着重要作用。O-GlcNAc糖基化影响细胞增殖、凋亡、衰老、分化、代谢调节、压力反应等,其异常与人类多种疾病有关。另外,磷酸化和O-GlcNAc糖基化在细胞生命活动中有着复杂联系:它们可以在蛋白质发生同、异位点竞争抑制和协同作用等现象。细胞周期蛋白(Cyclin D1)是细胞周期的正调节因子,caspase-3是直接作用于细胞引发凋亡的关键终端因子。O-GlcNAc糖基化抑制PKCα的活性。高糖环境TGF-β诱导的hBMSCs成软骨分化中活性降低、TGF-βRⅡ表达量下调。因此探究葡萄糖对hBMSCs的影响,及O-GlcNAc糖基化在其中发挥哪些作用有着重要价值。本课题研究中,我们首先观察体外培养微环境中高糖环境和细胞蛋白质高O-GlcNAc糖基化对hBMSCs增殖、衰老、凋亡和成软骨分化的影响,再对其中的部分机制进行了探索。二、研究方法1.实验分组:常糖组(葡萄糖5.5mmol/L),高糖培养基(葡萄糖25mmol/L),常糖O-GlcNAc糖基化组(葡萄糖5.5mmol/L,Thiamet-G 1.0mol/L),高糖O-GlcNAc糖基化组(葡萄糖25mmol/L,Thiamet-G 1.0mol/L)。Thiamet-G为O-GlcNAc糖基化水解酶抑制剂。成软骨分化常规诱导组、成软骨分化O-GlcNAc糖基化诱导组(Thiamet-G)、成软骨分化PKC抑制剂诱导组(G?6983)。G?6983为PKC活性抑制剂。2.葡萄糖对细胞蛋白质O-GlcNAc糖基化的影响。hBMSCs于常糖和高糖环境培养5天后,Western blot检测hBMSCs内总体蛋白质的O-GlcNAc糖基化水平3.葡萄糖与O-GlcNAc糖基化对hBMSCs增殖的影响。hBMSCs培养1、3、5、7天后,WST-1法检测hBMSCs增殖。4.葡萄糖与O-GlcNAc糖基化对hBMSCs周期作用。hBMSCs培养5天后,流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测细胞Cyclin D1表达水平。5.葡萄糖与O-GlcNAc糖基化对hBMSCs凋亡作用。hBMSCs培养5天后,流式细胞仪检测hBMSCs凋亡,RT-PCR检查caspase-3表达水平。6.葡萄糖与O-GlcNAc糖基化对hBMSCs衰老作用。hBMSCs培养5天后,β-半乳糖糖苷染色法检测hBMSCs衰老。7.葡萄糖与O-GlcNAc糖基化对hBMSCs向软骨分化作用。实时定量PCR检查成软骨分化的标志:Sox9、ColⅡ、AGN基因的表达;Western blot检测PKC、p-PKC、TGF-βRⅡ蛋白表达。三、研究结果1.高糖组相较于低糖组hBMSCs蛋白质O-GlcNAc糖基化水平升高。2.高糖组、低糖O-GlcNAc糖基化组和高糖O-GlcNAc糖基化组相较于低糖组抑制hBMSCs增殖。3.高糖组、低糖O-GlcNAc糖基化组和高糖O-GlcNAc糖基化组相较于低糖组阻滞hBMSCs G1/S期转换、下调Cyclin D1 m RNA表达。4.高糖组、低糖O-GlcNAc糖基化组和高糖O-GlcNAc糖基化组相较于低糖组促进hBMSs凋亡,上调caspase-3 m RNA表达。5.高糖组、低糖O-GlcNAc糖基化组相较于低糖组下调hBMSs成软骨分化标志Sox9、ColⅡ、AGN m RNA表达,阿尔新蓝染色变浅软骨组织中酸性粘多糖含量减少。6.成软骨分化O-GlcNAc糖基化诱导组、成软骨分化PKC抑制剂诱导组相较于成软骨分化常规诱导组,PKC表达量相同但磷酸化PKC表达量显著降低,TGF-βRⅡ表达显著下调。四、结论1.本研究证实微环境中高糖会促进hBMSCs细胞内蛋白质O-GlcNAc糖基化水平升高。鉴于O-GlcNAc糖基化在细胞生命活动的广泛作用,该结果产生的一系列生物学效应值得我们深入探究2.本研究证实高糖微环境抑制hBMSCs细胞增殖、阻滞其G1/S期转换、促进其凋亡和衰老。3.本研究证实蛋白质高O-GlcNAc糖基化抑制hBMSCs细胞增殖、阻滞其G1/S期转换、促进其凋亡和衰老。4.本研究证实高糖环境和高O-GlcNAc糖基化抑制hBMSCs成软骨分化。且PKC高O-GlcNAc糖基化下调PKC磷酸化及活性,进而引起TGF-βRⅡ表达量降低,最终导致TGF-β介导的hBMSCs成软骨分化进程受到抑制。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 葡萄糖 O-GlcNAc糖基化 增殖 周期 凋亡 衰老 成软骨分化
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 葡萄糖对O-GlcNAc糖基化的影响14-18
• 2.1 葡萄糖对O-GlcNAc糖基化的影响14-17
• 2.1.1 实验材料14-15
• 2.1.2 实验方法15-16
• 2.1.3 实验结果16-17
• 2.1.4 讨论17
• 2.2 小结17-18
• 第三章 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化对hBMSCs增殖、周期、凋亡和衰老的影响18-38
• 3.1 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化对hBMSCs增殖的影响18-21
• 3.1.1 实验材料18-19
• 3.1.2 实验方法19-20
• 3.1.3 实验结果20
• 3.1.4 讨论20-21
• 3.2 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化对hBMSCs周期的影响21-28
• 3.2.1 实验材料21-22
• 3.2.2 实验方法22-25
• 3.2.3 实验结果25-27
• 3.2.4 讨论27-28
• 3.3 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化对hBMSCs凋亡的影响28-34
• 3.3.1 实验材料28-29
• 3.3.2 实验方法29-31
• 3.3.3 实验结果31-33
• 3.3.4 讨论33-34
• 3.4 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化对hBMSCs衰老的影响34-37
• 3.4.1 实验材料34
• 3.4.2 实验方法34-36
• 3.4.3 实验结果36-37
• 3.4.4 讨论37
• 3.5 小结37-38
• 第四章 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化对hBMSCs成软骨分化的影响38-48
• 4.1 葡萄糖和O-GlcNAc糖基化对hBMSCs成软骨分化的影响38-47
• 4.1.1 实验材料38-39
• 4.1.2 实验方法39-43
• 4.1.3 实验结果43-46
• 4.1.4 讨论46-47
• 4.2 小结47-48
• 全文结论48-49
• 参考文献49-53
• 文献综述 O-GlcNAc糖基化：联系葡萄糖和细胞分化的桥梁53-71
• 参考文献59-71
• 读硕士学位期间发表论文情况71-72
• 致谢72

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本文编号：623302