靶向上皮细胞粘附分子单域抗体的筛选及其表达纯化

发布时间：2017-08-06 02:03

  本文关键词：靶向上皮细胞粘附分子单域抗体的筛选及其表达纯化

  更多相关文章： 癌症干细胞 单域抗体 上皮细胞粘附分子

【摘要】：目的:通过筛选噬菌体单域抗体文库,获得靶向上皮细胞粘附分子的单克隆单域抗体,并对候选单域抗体进行表达纯化,为今后将这些单域抗体用于癌症治疗奠定基础。方法:1.制备噬菌体单域抗体文库;2.选择可应用于后续淘选实验的抗原片段,并对其进行分析和合成;3.使用合成的上皮细胞粘附分子抗原片段对此文库进行5轮筛选;4.从第5轮筛选的单域抗体文库中随机挑取单克隆噬菌体抗体,检测其与抗原的结合;5.检测获得的单克隆噬菌体单域抗体与抗原结合的特异性及其DNA序列;6.检测获得的噬菌体单域抗体与完整的上皮细胞粘附分子的结合;7.对单域抗体进行蛋白表达纯化和鉴定。结果:1.成功地制备了噬菌体单域抗体文库,其滴度为4.4 X 1013 pfu/ml;2.选择了上皮细胞粘附分子基因第二个外显子编码的一段多肽作为抗原片段,并成功合成纯度达95%以上的抗原片段;3.完成了噬菌体单域抗体文库的5轮筛选;4.随机挑取和检测了478个单克隆噬菌体单域抗体,从中获得了30个候选单域抗体;5.通过进一步鉴定从中获得了17个单域抗体,分析其DNA序列,排除重复的序列后,获得5个不同的单域抗体;6.其中得到3个单克隆噬菌体单域抗体能够与完整的上皮细胞粘附分子结合;7.成功地表达和纯化了5个单域抗体,这些纯化的单域抗体能够与合成的抗原片段和完整的上皮细胞粘附分子结合。结论:本研究最终获得了5个单克隆噬菌体单域抗体,成功地表达和纯化了这些单域抗体,且获得的单域抗体能够与完整的上皮细胞粘附分子结合。
【关键词】：癌症干细胞 单域抗体 上皮细胞粘附分子
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 前言8-19
• 1 EpCAM的简介8-17
• 1.1 EpCAM蛋白的结构和表达8-11
• 1.2 EpCAM的活化11-12
• 1.3 EpCAM的一般功能12-13
• 1.4 EpCAM对癌细胞增殖的作用13-14
• 1.5 EpCAM在肿瘤形成中的作用14
• 1.6 EpCAM在癌症侵袭和转移中的作用14-16
• 1.7 EpCAM在肿瘤诊断和治疗中的作用16
• 1.8 EpCAM在癌细胞耐药性中的作用16-17
• 2 单克隆抗体17
• 3 噬菌体展示技术17-18
• 4 抗体片段和人源单域抗体18-19
• 第二章 材料和方法19-35
• 1 实验材料19-25
• 1.1 实验仪器19-20
• 1.2 主要实验试剂20-21
• 1.3 主要试剂的配制方法21-25
• 2 实验方法25-35
• 2.1 制备辅助噬菌体25-26
• 2.2 制备噬菌体单域抗体文库26
• 2.3 纯化噬菌体单域抗体文库26
• 2.4 筛选噬菌体单域抗体文库26-27
• 2.5 单克隆噬菌体ELSIA27-28
• 2.6 单域抗体的PCR扩增28-29
• 2.7 DNA琼脂糖凝胶电泳29
• 2.8 PCR产物的切胶回收29-30
• 2.9 双酶切反应30-31
• 2.10 酶连反应31
• 2.11 DH5α和BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞的制备31
• 2.12 将连接产物或质粒转化感受态细胞31-32
• 2.13 菌液PCR及DNA测序32
• 2.14 质粒小量抽提32-33
• 2.15 单域抗体的原核表达33-34
• 2.16 表达的蛋白质的亲和纯化步骤34
• 2.17 统计学分析34-35
• 第三章 实验结果35-56
• 1 噬菌体单域抗体文库的制备35
• 2 抗原片段的选择和制备35-40
• 3 噬菌体单域抗体文库的筛选40-42
• 4 单克隆噬菌体单域抗体的初步筛选42-44
• 5 单克隆噬菌体抗体与抗原结合特异性的分析44-45
• 6 单域抗体的氨基酸序列45-47
• 7 单克隆噬菌体单域抗体与完整的EpCAM蛋白结合的检测47-48
• 8 单域抗体的表达纯化48-54
• 9 纯化的单域抗体与EpCAM抗原结合的检测54-56
• 第四章 讨论56-58
• 第五章 结论58-59
• 参考文献59-66
• 在校期间发表论文情况66-67
• 致谢67

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 芦清霞;庆格乐图;杨春静;夏雪琴;李江伟;;骆驼重组SpaA-N单域抗体的制备与性质研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2012年01期

2 程巨龙,王祥斌,张众,刘晶,姚新生,黄华梁;一种构建改形单域抗体的方法(英文)[J];遗传学报;2002年03期

3 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 李英;尚伯杨;甄永苏;;大鼠轻链单域抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤作用[A];第四届中国肿瘤大会中国药理学会肿瘤药理专业委员会分会场学术会议论文摘要[C];2006年

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 马欢;分别筛选与分析抗VEGF和EGFR的人重链单域抗体[D];暨南大学;2016年

2 李英;大鼠抗肝癌单域抗体与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性研究[D];中国协和医科大学;2005年

中国硕士学位论文全文数据库 前4条

1 刘超;人工设计骆驼源单域抗体库构建及雌二醇抗体筛选[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年

2 张伟雄;靶向上皮细胞粘附分子单域抗体的筛选及其表达纯化[D];暨南大学;2016年

3 芦婷;双峰驼天然单域抗体库的构建及重链抗体特异性多抗的制备[D];内蒙古农业大学;2016年

4 余芳;RP215-VH单域抗体构建表达及活性研究[D];重庆医科大学;2014年

，

本文编号：627852