广谱中和活性样本功能性膜蛋白基因序列特征及中和表型分析

发布时间：2017-08-08 19:26

  本文关键词：广谱中和活性样本功能性膜蛋白基因序列特征及中和表型分析

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【摘要】：研究背景中和抗体能阻断病毒感染宿主靶细胞,是病毒疫苗的有效保护性组分。但目前研发的基于膜蛋白的HIV疫苗不能诱导广谱有效的中和抗体应答,这可能与膜蛋白基因的内在特性有一定关系。探讨HIV-1广谱中和活性样本膜蛋白基因序列及功能特征,以及功能性膜蛋白基因假病毒的中和表型,有助于理解机体免疫系统识别抗原及产生HIV-1广谱中和抗体的机制,为设计能诱导广谱中和抗体应答反应的免疫原提供参考依据。研究目的分析HIV-1感染者广谱中和活性样本功能性膜蛋白基因特征；分析功能性膜蛋白基因的假病毒对广谱中和抗体及对自体、异体血浆的中和敏感性。研究方法筛选HIV-1感染者具有广谱中和活性的样本,扩增全长膜蛋白基因,进行克隆构建及功能性鉴定。挑选代表性质粒,与HIV-1骨架质粒共转染293T/17细胞制备假病毒,分别与HIV-1广谱中和抗体、自身血浆和异体血浆进行中和反应,分析假病毒的中和敏感性；同时对功能性质粒进行测序,应用Bioedit、Mega、Geno2pheno等软件分析env基因特征及其与广谱中和活性相关的关键氨基酸变异。研究结果1、从具有广谱中和活性的CBJC437、CBJC501、CBJC515三例感染者的不同时间点样本中筛选了28个有代表性的功能性膜蛋白基因,其中CBJC437样本15条、CBJC501样本9条、CBJC515样本4条。2、序列分析显示所获得的膜蛋白基因V1V2、V4区的基因距离差异显著,V3、V5区差异小。功能性env基因全部呈CCR5嗜性,SGA序列多以CCR5嗜性为主,但随时间推移,部分序列预测转变为CXCR4嗜性。3、广谱中和单抗识别的关键位点氨基酸在所获得的功能性env基因中存在不同类型和不同程度的突变。4、感染者各时间点功能性env基因构建的假病毒对单抗2F5和10E8均敏感,对单抗2G12、4E10、12A21、PGT121、PGT135及VRC01的中和敏感性存在差异。5、样本各时间点病毒多能被自身血浆中和,早期时间点的病毒对较晚时间点血浆的中和更为敏感。多数病毒对同亚型异体血浆的中和敏感。研究结论广谱中和活性样本功能性膜蛋白基因的假病毒对单抗2F5和10E8均敏感,对单抗2G12、4E10、12A21、PGT121、PGT135 及 VRCO1的中和敏感性存在差异。样本各时间点病毒多能被自身血浆中和,早期时间点的病毒对较晚时间点血浆的中和更为敏感。多数病毒对同亚型异体血浆的中和敏感。
【关键词】：人类免疫缺陷病毒 广谱中和抗体 假病毒 突变
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 英文缩略词表11-13
• 前言13-15
• 材料和方法15-36
• 1. 主要仪器与试剂15-18
• 1.1. 主要仪器15-16
• 1.2. 主要试剂16-17
• 1.3. 细胞系及溶液17-18
• 2. 研究对象和实验方法18-33
• 2.1. 研究对象18
• 2.2. 病毒血浆RNA提取18-19
• 2.3. 逆转录合成cDNA19-21
• 2.4. 巢式PCR(nested-PCR)扩增env基因21-23
• 2.5. env基因PCR产物鉴定23
• 2.6. env基因PCR产物纯化回收23-24
• 2.7. 克隆构建24-25
• 2.8. 提取质粒25-26
• 2.9. 质粒鉴定26
• 2.10. 功能性克隆筛选26-29
• 2.11. 功能性env质粒及假病毒制备29-31
• 2.12. 假病毒滴定31
• 2.13. 中和实验分析31-33
• 3. 功能性env基因序列及SGA序列分析33-34
• 3.1. 系统进化分析33-34
• 3.2. 嗜性及特征性氨基酸分析34
• 4. 病毒的中和敏感性分析34-35
• 5. 统计分析35-36
• 结果36-67
• 1. 研究对象基本信息36-37
• 2. env功能性膜蛋白基因及SGA序列特征分析37-53
• 2.1. 功能性env基因及SGA序列系统进化分析37-42
• 2.2. 功能性env基因及SGA序列基因距离42-45
• 2.3. 功能性env基因V1-V5可变区序列长度及PNGS分析45
• 2.4. env基因SGA序列V1-V5可变区序列长度及PNGS分析45-46
• 2.5. V3区特征分析46-53
• 3. 中和表位关键氨基酸变异分析53-60
• 3.1. 功能性env基因中和表位关键氨基酸变异分析53-55
• 3.2. env基因SGA序列中和表位关键氨基酸变异分析55-60
• 4. 功能性env基因的中和表型60-67
• 4.1. 功能性env基因筛选60
• 4.2. 病毒对广谱中和单抗的敏感性60-62
• 4.3. 病毒的自体血浆中和反应62-64
• 4.4. 病毒的同亚型异体血浆中和反应64-67
• 讨论67-71
• 小结71-72
• 参考文献72-75
• 综述75-83
• 参考文献80-83
• 个人简介83-84
• 论文发表情况84-85
• 致谢85

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本文编号：641683