新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究

发布时间：2017-08-11 06:04

  本文关键词：新型结核病疫苗菌株的生物特性和遗传性状研究

  更多相关文章： B/R融合菌株 BCG H37Ra菌株 结核疫苗 生长特性 定植性 遗传性

【摘要】：目的:探讨卡介苗(BCG)与结核分枝杆菌国际标准无毒株(H37Ra)构建的融合菌株(B/R菌株)的生长特性、定植性及遗传稳定性。方法:1.Sauton液体培养基分别培养BCG、H37Ra和B/R菌株,并在连续培养的第3、6、9、12、15、18、21、24、27、30天(d)取菌液并测定其在波长600nm处的OD值。然后以时间(Time)为横坐标,OD600值为纵坐标,绘制上述三种菌株的生长曲线。2.C57BL/6小鼠随机分3组,分别皮下接种BCG、H37Ra和B/R菌株的菌液0.1m L(含活菌数为1.0×106个),免疫后的第15、30、45、60及75天取各组小鼠脾脏、肺脏及肝脏,制成脏器组织匀浆,取匀浆液0.1m L接种于罗氏固体培养基斜面上,培养20天,分别计算三组菌株在不同脏器的菌落数(Log10cfu)。3.提取B/R菌株、BCG和H37Ra菌株的总RNA,进行纯度鉴定后并逆转录成c DNA,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测上述三种菌株esat-6、ag85b、mpt70和mpt83基因的m RNA相对表达水平,比较三种不同菌株中esat-6、ag85b、mpt70和mpt83基因表达的差异。4.分别提取B/R菌株第1代到第20代的基因组DNA,以其为模版PCR分别扩增每代B/R菌株的esat-6、ag85b、mpt70和mpt83基因,比较分析B/R菌株的传代稳定性。结果:1.根据所绘生长曲线图,与亲本菌株BCG和H37Ra菌株相比,B/R菌株的生长适应期较长,6天后才开始进入生长对数期,27天后进入平台稳定期;2.在相同免疫时间下,B/R菌株在小鼠不同脏器内的Log10cfu均高于BCG和H37Ra菌株。其中,与BCG和H37Ra菌株组比较,B/R菌株在小鼠肝脏内的Log10cfu稍高,但差异无统计学意义(P0.05)。且随着免疫时间的增加,三种菌株在小鼠肝脏内的Log10cfu有升有降,时间趋势不明显。在五个不同免疫时间点,B/R菌株在小鼠脾脏内的Log10cfu均明显高于BCG菌株,且差异有统计学意义(P0.05);在免疫后的15、45以及75天,B/R菌株在小鼠脾脏内的Log10cfu高于H37Ra菌株,且差异有统计学意义(P0.05)。且随着免疫时间的增加,三种菌株在小鼠脾脏内的Log10cfu整体呈下降趋势,但在免疫后的75天,H37Ra和B/R菌株在小鼠脾脏内的Log10cfu较60天组有小幅度的上升,而BCG在小鼠脾脏内的Log10cfu仍呈下降趋势。在五个不同免疫时间点,B/R菌株在小鼠肺脏内的Log10cfu均明显高于BCG菌株,且差异有统计学意义(P0.05);在免疫后的15和45天,B/R菌株在小鼠肺脏内的Log10cfu高于H37Ra菌株,且差异有统计学意义(P0.05)。且随着免疫时间的增加,三种菌株在小鼠肺脏内的Log10cfu明显呈下降趋势。3.q RT-PCR检测结果显示,与BCG菌株比较,mpt70和mpt83基因在B/R融合菌株中的m RNA表达量有不同程度的下调,但差异无统计学意义(P0.05);在H37Ra菌株中的m RNA表达量也有不同程度的下调,且差异有统计学意义(P0.05)。与H37Ra菌株比较,mpt70和mpt83基因在B/R融合菌株和BCG菌株中的m RNA表达量均有不同程度的上调,且差异有统计学意义(P0.05);esat-6和ag85b在B/R菌株中的m RNA表达量均有不同程度的上调,且差异有统计学意义(P0.05)。4.PCR扩增结果显示,第1代到第20代的B/R菌株均能扩增出的esat-6、ag85b、mpt70和mpt83四个目的基因,且大小位置相同,条带清晰明亮。结论:1.B/R菌株的生长周期为30天,其在小鼠体内至少可存活75天,且定植能力较强。2.B/R菌株在20个代次以内的基因水平达到了生物制品传代稳定性的要求。
【关键词】：B/R融合菌株 BCG H37Ra菌株 结核疫苗 生长特性 定植性 遗传性
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 英汉缩略语名词对照表9-11
• 前言11-14
• 材料和方法14-27
• 结果27-36
• 讨论36-39
• 结论39-40
• 参考文献40-43
• 文献综述43-55
• 参考文献52-55
• 致谢55-56
• 作者简介56-57
• 导师评阅表57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组;第四次全国结核病流行病学抽样调查报告[J];中华结核和呼吸杂志;2002年01期

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本文编号：654503