Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗毒种的遗传稳定性研究及Sabin株病毒深度测序方法的探索

发布时间：2017-08-11 19:12

  本文关键词：Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗毒种的遗传稳定性研究及Sabin株病毒深度测序方法的探索

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【摘要】：脊髓灰质炎(Poliomyelitis,以下简称脊灰)是由脊髓灰质炎病毒(Poliomyelitis Virus, PV)感染引起、危害极大的急性传染病,尚无有效治疗方法,只能通过疫苗预防。口服脊灰减毒活疫苗(Oral Poliomyelitis Vaccine, OPV)因接种方便,成本相对较低而一度被广泛使用,但可能引起脊灰疫苗相关麻痹病例(Vaccine-Associated Paralytic Poliomyelitis, VAPP)和疫苗衍生株脊灰病毒(Vaccine-Derived Poliovirus, VDPV)病例,灭活脊灰疫苗(Inactivated poliomyelitis vaccine, IPV)能有效避免VAPP和VDPV,采用IPV取代OPV是《全球消灭脊灰战略终结计划》的要求。而在全世界消灭脊灰后,采用野毒株(Salk)生产IPV对生物安全水平要求更加严格,因此WHO鼓励疫苗厂家研发Sabin株脊灰灭活疫苗(Inactivated Poliomyelitis Vaccine, Sabin strain, sIPV)o在研发sIPV过程中,Sabin株毒种的遗传稳定性极其重要。本研究通过检测PV感染性滴度、D抗原含量以及PV全基因组Sanger测序的方法来检测制备的工作种子和疫苗代次病毒的遗传稳定性。此外,生产中在对疫苗质量进行监测时,需区别通过和未通过猴体神经毒力试验(Monkeys Neurovirulence Test, MNVT)的疫苗之间的差别；而采用聚合酶链式反应和限制性内切酶酶切技术作突变分析(Mutant Analysis by PCR and Restriction Enzyme Cleavage, MAPREC)虽然可以准确地测定出一个碱基位点突变的量,但无法实现对基因组每个核苷酸的序列变化都进行监测。随着分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善,第二代测序技术(Next Generation Sequencing, NGS)的出现,使得基因检测效率不断提高,从分子水平来监测疫苗质量更容易实现。本研究通过对Sabin株病毒NGS模板制备方法的讨论,探讨了如何去除背景核酸的干扰、低浓度样品的扩增方法选择、样品的纯化定量筛选以及质量鉴定,以及测序平台的选择等问题。目的1.分析sIPV毒种(亚主种子、工作种子)及疫苗代次病毒(SO+4)、SO+5、SO+6的遗传稳定性；2.初步建立Sabin株病毒NGS样品的预处理方法、扩增方法、纯化筛选方法以及测序平台选择等问题,以期为进一步研究Sabin株的遗传稳定性构建一种切实可行的新方法。方法1.比较疫苗株Sabin Ⅰ、Ⅱ型及PfizerⅢ型亚主种子、工作种子及疫苗代次病毒、SO+5、SO+6的感染性滴度及D抗原含量的变化情况,并对上述病毒进行全基因组测序；2.采用常用的NGS样品的预处理方法、扩增方法、纯化等方法制备Sabin株病毒NGS测序模板,比较筛选适用Sabin株病毒NGS的最佳组合,并对制备的模板进行定量和质量鉴定。结果1.各代次Sabin株病毒滴度均维持在7.62～8.62 1gCCID50/ml,D抗原含量均维持在30～128 DU/ml.与GenBank上登录的Sabin Ⅰ (AY184219.1)、Ⅱ型(AY184220.1)及Sabin Ⅲ型(AY184221.1)减毒株原始种子(SO)基因序列相比,Sabin株亚主种子(S0+2)、工作种子(S0+3)及疫苗代次病毒(S0+4)、SO+5、SO+6均未出现碱基突变；2. Sabin株病毒NGS模板制备的样品预处理是必要的,选用不依赖序列的单引物扩增效果最好,优化了磁珠纯化法的磁珠用量,且采用Qubit定量系统定量更精确。结论1.sIPV毒种及疫苗代次病毒、SO+5、SO+6的病毒全基因序列与原始种子相比,均未发生变化,毒力均一,遗传性状方面保持了较好的稳定性；2.初步建立了Sabin株病毒NGS的模板制备方法,并成功制备了Sabin株病毒NGS模板。
【关键词】：Sabin株 脊髓灰质炎灭活疫苗 毒种全基因组测序 毒种第二代测序 毒种遗传稳定性
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-15
• 1、Sabin株脊髓灰质炎疫苗毒种遗传稳定性研究的意义及进展9-12
• 2、Sabin株病毒深度测序的意义及现状12-15
• 一、实验材料和实验方法15-40
• (一) 材料和仪器设备15-18
• 1、细胞15
• 2、脊灰病毒毒种15-16
• 3、试剂和器材16-17
• 4、主要仪器设备17-18
• 5、查询使用的主要生物信息学工具18
• (二) 实验方法18-40
• 1、细胞培养18-19
• 2、病毒培养19-20
• 3、病毒滴度的检测20
• 4、ELISA法测定D抗原含量20-22
• 5、病毒RNA提取22-24
• 6、Sanger测序引物设计及合成24-26
• 7、Sanger测序RT-PCR26-29
• 8、高保真酶DNA扩增29-31
• 9、Sanger测序病毒基因序列的分析31
• 10、NGS样品的预处理方法31-32
• 11、NGS模板的扩增方法32-35
• 12、NGS模板纯化方法35-36
• 13、NGS模板定量36-38
• 14、NGS模板质量鉴定38-40
• 二、实验结果40-57
• (一) sIPV毒种遗传稳定性研究结果40-45
• 1、不同代次Sabin株的病毒滴度和D抗原含量40
• 2、RNA提取结果40-41
• 3、Sanger测序RT-PCR产物电泳检测结果41-42
• 4、Sanger测序全基因序列比对结果42-45
• (二) Sabin株病毒深度测序模板制备方法探索结果45-57
• 1、RNA提取后是否进行DNase Ⅰ消化电泳检测结果45-46
• 2、NGS模板扩增方法的优化结果46-48
• 3、NGS模板制备的RT-PCR产物鉴定结果48-49
• 4、磁珠纯化产物的电泳检测、定量及质量鉴定结果49-56
• 5、制备模板的完整性检测结果56-57
• 三、讨论57-66
• (一) sIPV毒种遗传稳定性研究57-59
• 1、sIPV毒种全基因组测序分析57-58
• 2、sIPV毒种感染性滴度和D抗原含量58
• 3、小结58-59
• (二) Sabin株深度测序模板制备方法探索59-64
• 1、Sabin株病毒NGS样品的预处理59
• 2、Sabin株病毒NGS模板扩增方法59-61
• 3、Sabin株病毒NGS模板纯化方法61-62
• 4、Sabin株病毒NGS模板定量62-63
• 5、Sabin株病毒NGS模板质量鉴定63-64
• 6、小结64
• (三) 结论与展望64-66
• 参考文献66-71
• 附录71-75
• 附录1 中英文缩略词对照表71-73
• 附录2 主要试剂的配制73-75
• 致谢75-76
• 研究生简历76-77

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本文编号：657799