mICAM-1在MSCs和EPCs间黏附作用的研究

发布时间：2017-08-16 08:27

  本文关键词：mICAM-1在MSCs和EPCs间黏附作用的研究

  更多相关文章： 间充质干细胞 内皮祖细胞 细胞间黏附分子-1 IL-1β P38MAPK通路

【摘要】：目的探讨细胞间黏附分子1(ICAM-1)在间充质干细胞(MSCs)和血管内皮前体细胞(EPCs)间黏附作用及其机制的研究。方法1.分离、培养及扩增来源于6-8周龄的C57BL/6小鼠骨髓的MSCs和EPCs;2.Elisa方法检测MSCs,EPCs,MSCsEPCs,EPCs-CM-MSCs和MSCs-CM-EPCs条件培养基(-CM)中IL-1β的表达水平;3.细胞免疫荧光检测ICAM-1在正常组、IL-1β刺激组、P38MAPK通路抑制剂SB203580刺激组中MSCs组、EPCs组、MSCs+EPCs共培养组(MSCEPC)ICAM-1的表达情况;4.通过Western blot技术检测ICAM-1在正常组、IL-1β刺激组、P38MAPK通路抑制剂SB203580组中ICAM-1蛋白和P38MAPK通路蛋白的表达水平进行检测;5.通过添加相应浓度抗ICAM-1中和抗体、IL-1β、SB203580,在基质胶上观察MSCs和EPCs间黏附的变化。结果1.通过Elisa方法检测MSCs,EPCs,MSCsEPCs,EPCs-CM-MSCs和MSCs-CM-EPCs中IL-1β的表达水平。所有的细胞均以同样的密度种植,且使用无血清、无生长因子的无菌PBS培养,诱导时间均为24 h。结果显示,MSCs组(8.96±2.70 ng/ml,*P0.05)和EPCs组(22.14±1.83 ng/ml,*P0.05)均可分泌IL-1β,但MSCsEPCs组(49.13±6.21ng/ml)分泌量明显高于MSCs组和EPCs组,差异有统计学意义。EPCs-CM-MSCs组(35.02±1.19 ng/ml)和MSCs-CM-EPCs组(33.85±1.37 ng/ml)IL-1β的分泌量明显高于MSCs组(8.96±2.70 ng/ml,*P0.05)和EPCs组(22.14±1.83 ng/ml,*P0.05),差异有统计学意义,但并不高于MSCsEPCs组(49.13±6.21 ng/ml,P0.05)。2.通过细胞免疫荧光检测IL-1β诱导组、正常组及P38MAPK通路抑制剂组ICAM-1的表达水平。每个细胞玻片以相同的细胞密度于60 mm细胞培养皿中培养24 h。然后使用无血清及生长因子的培养基替代,加入IL-1β(25μg/ml)及P38MAPK通路抑制剂SB203580(20μmol/ml)诱导24 h,正常组不添加任何药物处理。结果显示MSCs和EPCs均低表达ICAM-1,且MSCsEPCs促进ICAM-1的表达。IL-1β促进MSCs、EPCs及MSCsEPCs ICAM-1的表达,P38MAPK通路抑制剂SB203580下调MSCs、EPCs及MSCsEPCs ICAM-1的表达。IL-1β诱导组ICAM-1表达高于正常组和P38MAPK通路抑制剂SB203580诱导组的相应各组,且P38MAPK通路抑制剂SB203580诱导组的相应各组ICAM-1表达较正常组下调。3.通过Western blot检测ICAM-1及P38MAPK蛋白的表达水平。MSCs,EPCs和MSCsEPCs组均表达ICAM-1和P38MAPK通路蛋白,结果以ICAM-1/GAPDH IOD平均水平和p-P38MAPK/total-P38MAPK IOD平均水平表示。结果显示正常组MSCsEPCs组(0.21±0.01,*P0.05)ICAM-1蛋白的表达量较正常组MSCs组(0.11±0.02,*P0.05)和EPCs组(0.11±0.02,*P0.05)高。IL-1β诱导组MSCsEPCs组(0.38±0.02,*P0.05)ICAM-1蛋白的表达量较同组内MSCs组(0.23±0.02,*P0.05)和EPCs组(0.25±0.02,*P0.05)高。P38MAPK通路抑制剂SB203580诱导组MSCsEPCs组(0.10±0.02,*P0.05)ICAM-1蛋白的表达量较同组内MSCs组(0.05±0.01,*P0.05)和EPCs组(0.05±0.01,*P0.05)高。IL-1β诱导组的MSCs组、EPCs组及MSCsEPCs组ICAM-1蛋白的表达量均高于相应的正常组和P38MAPK通路抑制剂SB203580诱导组。正常组的MSCs组、EPCs组及MSCsEPCs组ICAM-1蛋白的表达量均高于相应的P38MAPK通路抑制剂SB203580诱导组。正常组MSCsEPCs组(0.52±0.02,*P0.05)p-P38MAPK通路蛋白的表达量较正常组MSCs组(0.35±0.02,*P0.05)和EPCs组(0.36±0.01,*P0.05)高。IL-1β诱导组MSCsEPCs组(0.74±0.06,*P0.05)p-P38MAPK通路蛋白的表达量较同组内MSCs组(0.54±0.04,*P0.05)和EPCs组(0.47±0.03,*P0.05)高。P38MAPK通路抑制剂SB203580诱导组MSCsEPCs组(0.37±0.02,*P0.05)p-P38MAPK通路蛋白的表达量较同组内MSCs组(0.26±0.03,*P0.05)和EPCs组(0.17±0.01,*P0.05)高。IL-1β诱导组的MSCs组、EPCs组及MSCsEPCs组p-P38MAPK通路蛋白表达量均高于正常组和P38MAPK通路抑制剂SB203580诱导组。正常组的MSCs组、EPCs组及MSCsEPCs组p-P38MAPK通路蛋白表达量均高于相应的P38MAPK通路抑制剂SB203580诱导组。各组total-P38MAPK通路蛋白表达水平没有明显差异。4.MSCs和EPCs间的黏附实验。实验中我们以DAPI标记MSCs,以Mitotracker red标记EPCs。将标记后的MSCs和EPCs细胞在铺有基质胶的24孔板上进行共培养,同时依次添加抗ICAM-1中和抗体、IL-1β和P38MAPK通路抑制剂SB203580,正常组不做处理。结果显示加入抗ICAM-1中和抗体和P38MAPK通路抑制剂SB203580组中MSCs和EPCs的黏附较正常组降低,而添加IL-1β诱导组MSCs和EPCs的黏附较正常组增多。结论1.利用全骨髓贴壁法结合差时贴壁法可有效分离和扩增MSCs和EPCs细胞。2.ICAM-1参与介导MSCs和EPCs间的黏附过程。3.IL-1β促进ICAM-1的表达增高以增强MSCs和EPCs间的黏附通过P38MAPK通路;4.MSCs和EPCs黏附通过直接和间接分泌的方式共同调节IL-1β的分泌。
【关键词】：间充质干细胞 内皮祖细胞 细胞间黏附分子-1 IL-1β P38MAPK通路
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-13
• 英文缩略语表13-14
• 前言14-15
• 第一部分：C57BL/6 小鼠骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞的分离、扩增及培养15-19
• 实验一：C57BL/6 小鼠骨髓间充质干细胞及血管内皮前体细胞的分离、扩增及培养15-19
• 1 材料15-16
• 1.1 主要仪器和试剂15-16
• 1.2 实验动物16
• 1.3 主要溶液的配制16
• 2 方法16-17
• 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）的分离和培养16-17
• 2.2 小鼠血管内皮前体细胞（EPCs）的分离和培养17
• 3 结果17-18
• 3.1 MSCs及EPCs的形态学特征17-18
• 4 讨论18-19
• 第二部分：细胞间黏附分子 1（ICAM-1）在间充质干细胞（MSCs）和血管内皮前体细胞（EPCs）间黏附作用的研究19-34
• 实验一：细胞间黏附分子 1（ICAM-1）在间充质干细胞（MSCs）和血管内皮前体细胞（EPCs）间黏附作用的研究19-34
• 1 材料19-20
• 1.1 主要仪器和试剂19-20
• 1.2 实验动物20
• 2 方法20-29
• 2.1 细胞免疫荧光检测MSCs、EPCs及MSCs&EPCs组中ICAM-1 表达20-21
• 2.2 实时定量PCR（ RT-PCR）检测MSCs、EPCs及MSCs&EPCs组中ICAM-1m RNA表达水平21-23
• 2.2.1 细胞准备及总RNA提取21-22
• 2.2.2 反转录22
• 2.2.3 荧光定量PCR检测22-23
• 2.3 Western blotting检测MSCs、EPCs及MSCs&EPCs组中ICAM-1 蛋白表达水平23-27
• 2.3.1 细胞准备23
• 2.3.2 细胞总蛋白的提取23-24
• 2.3.3 Western blot相关试剂的配制24-26
• 2.3.4 凝胶的配制26
• 2.3.5 凝胶电泳26-27
• 2.3.6 转印蛋白及免疫检测27
• 2.4 MSCs和EPCs的黏附实验27-29
• 2.4.1 细胞准备27-28
• 2.4.2 Mitotracker red的配制28
• 2.4.3 DAPI标记MSCs28
• 2.4.4 Mitotracker red标记EPCs28
• 2.4.5 黏附实验28-29
• 2.5 统计学方法29
• 3 结果29-32
• 3.1 细胞免疫荧光及荧光半定量检测ICAM-1 表达水平29-30
• 3.2 RT-PCR检测ICAM-1 m RNA表达水平30
• 3.3 Western blot检测ICAM-1 蛋白表达水平30-31
• 3.4 抗ICAM-1 抗体对MSCs和EPCs间黏附作用的影响31-32
• 4 讨论32-34
• 第三部分：白细胞介素 1（IL-1）诱导细胞间黏附分子 1（ICAM-1）表达增强促进骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）和血管内皮前体细胞（EPCs）间黏附作用通过P38MAPK通路的研究34-44
• 实验一：白细胞介素 1（IL-1）诱导细胞间黏附分子 1（ICAM-1）表达增强促进骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）和血管内皮前体细胞（EPCs）间黏附作用通过P38MAPK通路的研究34-44
• 1 材料34-35
• 1.1 主要仪器和试剂34
• 1.2 实验动物34
• 1.3 主要溶液的配制34-35
• 2 方法35-37
• 2.1 条件培养基的提取35
• 2.2 Elisa检测条件培养基中IL-1β 的表达水平35-37
• 2.3 细胞免疫荧光检测IL-1β 诱导组、正常组及P38MAPK通路抑制剂组ICAM-1 的表达水平37
• 2.3.1 细胞准备37
• 2.3.2 细胞免疫荧光检测IL-1β 诱导组、正常组及P38MAPK通路抑制剂组ICAM-1 的表达水平37
• 2.4 Western blot检测IL-1β 诱导组、正常组及P38MAPK通路抑制剂组ICAM-1的表达水平37
• 2.5 黏附实验37
• 2.6 统计学方法37
• 3 结果37-42
• 3.1 Elisa检测条件培养基中IL-1β 的表达水平37-38
• 3.2 细胞免疫荧光检测IL-1β 诱导组、正常组及P38MAPK通路抑制剂组ICAM-1 的表达水平38-40
• 3.3 Western blot检测ICAM-1 及P38MAPK蛋白的表达水平40-42
• 3.4 MSCs和EPCs间的黏附实验42
• 4 讨论42-44
• 结论44-45
• 参考文献45-50
• 综述50-65
• 参考文献58-65
• 致谢65-66
• 作者简介66-67
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表67

，

本文编号：682268