利用脂肪细胞和肠上皮细胞特异性敲除小鼠研究Metrnl表达和功能

发布时间：2017-08-20 21:33

  本文关键词：利用脂肪细胞和肠上皮细胞特异性敲除小鼠研究Metrnl表达和功能

  更多相关文章： Metrnl ELISA 脂肪细胞 胰岛素敏感性 肠上皮细胞 抗菌肽

【摘要】：背景脂肪因子在调控脂肪组织功能和机体代谢方面发挥着重要作用。Metrnl是我们课题组新发现的脂肪因子。该蛋白在机体多种组织中表达,尤其在白色脂肪和粘膜组织中高表达。目前文献报道,Metrnl具有神经营养因子的作用,促进轴突生长和神经细胞迁移;脂肪形成和肥胖时Metrnl表达上调。本课题研究Metrnl组织表达谱,聚焦于Metrnl高表达的脂肪组织和肠道组织,通过创制细胞特异性基因敲除小鼠探索Metrnl功能。方法1.考察小鼠Metrnl ELISA试剂盒的灵敏度、精确度、特异性等,建立一套稳定准确的Metrnl检测方法。2.利用Metrnlloxp/loxp小鼠和Fabp4-Cre小鼠交配,制备Metrnl脂肪细胞特异性敲除小鼠。3.正常饮食下,取Metrnl脂肪细胞特敲小鼠和野生型小鼠脂肪组织、肝脏、肌肉、心脏和脑组织检测Metrnl mRNA水平,利用ELISA方法检测Metrnl血液水平。另外,监测小鼠能量消耗和进行葡萄糖耐量实验。高脂饮食下,监测Metrnl脂肪细胞特敲小鼠和野生型小鼠能量消耗,并进行葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验。HE染色观察小鼠白色脂肪组织形态和real-time PCR分析棕色脂肪脂代谢和产热相关基因表达。4.利用正常人组织芯片进行Metrnl免疫组织化学分析,以及利用real-time PCR方法分析C57BL/6小鼠组织Metrnl mRNA表达。5.利用Metrnlloxp/loxp小鼠和Villin-Cre小鼠交配,制备Metrnl肠上皮细胞特异性敲除小鼠。6.考察Metrnl肠上皮细胞特敲小鼠和野生型小鼠体重和结肠长度,HE染色观察结肠形态和利用ELISA方法检测血液和肠液Metrnl水平。肠道粘液染色分析肠道粘蛋白的分泌,以及利用real-time PCR方法分析肠上皮细胞中抗菌肽mRNA表达水平如Regenerating islet-derived 3 gamma(Reg3g)、Lactortansfferin、Serum amyloid a-3(SAA3)和Regenerating islet-derived 3 beta(Reg3b)。结果1.建立了一套成熟稳定准确的Metrnl ELISA检测方法。该方法灵敏度高,精密度的变异系数为5-15%,且只能由于检测小鼠血液Metrnl,大鼠和人血液都不能检测。另外,小鼠血液的采集方法必须一致,否则影响Metrnl值的比较。2.成功制备Metrnl脂肪细胞特异性敲除小鼠模型。脂肪组织Metrnl表达下降57%,而肝脏、肌肉、心脏和脑组织Metrnl表达不改变。Metrnl脂肪细胞特异性敲除后小鼠血液水平有降低趋势,无显著差异。3.正常饮食下,与野生型小鼠相比,Metrnl脂肪细胞特异性敲除小鼠的能量消耗和葡萄糖耐受能力不受影响。高脂饮食下,与野生型小鼠相比,Metrnl脂肪细胞特敲小鼠白色脂肪细胞显著变小,机体胰岛素抵抗加重,但棕色脂肪脂代谢和产热相关基因mRNA表达无明显变化。4.正常人组织Metrnl免疫组化和C57BL/6小鼠组织Metrnl mRNA表达水平表明,Metrnl在人和小鼠组织中表达谱几乎一致,且肠上皮细胞Metrnl表达最高。5.成功制备Metrnl肠上皮细胞特异性敲除小鼠模型。肠上皮细胞Metrnl表达下降96%,而肝脏、肌肉、心脏和脂肪组织Metrnl表达不改变。Metrnl肠上皮细胞特敲后小鼠血液水平有降低趋势无显著差异,而肠液Metrnl水平显著降低。6.与野生型小鼠相比,Metrnl肠上皮细胞特敲小鼠体重和结肠长度,结肠形态也没有显著变化。肠道粘液染色没有发现其分泌有明显变化,肠上皮Mucin2表达也没有差异。但肠上皮细胞中抗菌肽mRNA表达减少如Reg3g和Lactotransfferin分泌显著减少,SAA3和Reg3b有减少趋势。结论Metrnl脂肪细胞特异性敲除不会引起血液Metrnl水平显著下降;Metrnl肠上皮细胞特异性敲除不会引起血液Metrnl水平显著下降,但导致肠液Metrnl水平显著降低。脂肪细胞Metrnl能增强机体胰岛素敏感性;肠上皮细胞Metrnl能促进肠上皮细胞抗菌肽表达,Metrnl可能参与肠道免疫调节。
【关键词】：Metrnl ELISA 脂肪细胞 胰岛素敏感性 肠上皮细胞 抗菌肽
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-12
• 前言12-16
• 一、实验材料16-19
• （一）试剂和耗材16-17
• （二）实验仪器17-19
• 二、实验方法19-29
• （一）小鼠基因型鉴定19-20
• （二）小鼠体重、食量记录和能量消耗测定20-21
• （三）葡萄糖耐量实验21
• （四）胰岛素耐量实验21-22
• （五）小鼠血液标本和肠液标本采集22
• （六）组织形态学实验22-24
• （七）Metrnl等基因mRNA表达检测24-26
• （八）Metrnl免疫组织化学检测26
• （九）Metrnl ELISA检测26-29
• 三、实验结果与讨论29-43
• （一）Metrnl ELISA方法学考察29-32
• 1. 检测方法的灵敏度29
• 2. 检测方法的精密度29-30
• 3. 检测上限的延伸30
• 4. 检测方法的种属特异性30-31
• 5. 不同血液的采集方法对Metrnl的影响31-32
• （二）Metrnl脂肪细胞特敲小鼠培育和胰岛素敏感性研究32-38
• 1. Metrnl脂肪细胞特异性敲除小鼠的培育32
• 2. Metrnl脂肪细胞特异性敲除小鼠的验证32-33
• 3. 正常饮食下，Metrnl对小鼠体重、食量和能量消耗的影响33
• 4. 正常饮食下，，Metrnl脂肪细胞特敲对胰岛素敏感性的影响33-34
• 5. 高脂饮食下，Metrnl对小鼠体重、食量和能量消耗的影响34
• 6. 高脂饮食下，Metrnl脂肪细胞特敲对胰岛素敏感性的影响34-35
• 7. 高脂饮食下，Metrnl对小鼠肝脏和脂肪组织重量的影响35-36
• 8. 高脂饮食下，Metrnl对棕色脂肪脂代谢和产热功能的影响36
• 9. 高脂饮食下，Metrnl脂肪细胞特敲对白色脂肪组织形态的影响36-38
• （三）Metrnl肠上皮细胞特敲小鼠培育和功能探索38-43
• 1. 正常人组织Metrnl表达谱38
• 2. C57BL/6 小鼠组织Metrnl表达谱38-39
• 3. Metrnl肠上皮细胞特异性敲除小鼠的培育39-40
• 4. Metrnl肠上皮细胞特异性敲除小鼠的验证40
• 5. Metrnl肠上皮细胞特敲小鼠体重和结肠形态学观察40-41
• 6. Metrnl肠上皮细胞特敲小鼠血液和肠液Metrnl水平41
• 7. Metrnl对小鼠肠道粘液分泌和抗菌肽表达的影响41-43
• 全文总结43-44
• 参考文献44-48
• 综述48-59
• 参考文献54-59
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况59-60
• 附录60-72
• 致谢72

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本文编号：709016