呼吸道合胞病毒双顺反子微型基因组的构建及拯救

发布时间：2017-08-21 01:13

  本文关键词：呼吸道合胞病毒双顺反子微型基因组的构建及拯救

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【摘要】：目的：构建可表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)或分泌型荧光素酶(Gaussia luciferase, Gluc)报告基因的单/双顺反子人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)微型基因组cDNA克隆并进行拯救,以探讨并验证RSV的辅助蛋白在RSV反向遗传学操作中的作用,同时,构建以巨细胞病毒(Cytomegalo virus, CMV)启动子为表达盒、密码子优化的辅助蛋白质粒系统,用于开展微型基因组拯救及RSV辅助蛋白功能的研究。方法：通过分子生物学技术,将人工合成的带EGFP基因的微型基因组cDNA克隆在改造的pBR322B载体上；将EGFP基因替换为Gluc报告基因,获得分别表达EGFP及Glue的单顺反子微型基因组,向上述质粒中插入一个编码无生物活性的蛋白的开放阅读框(open reading frame, ORF),获得分别表达EGFP或Gluc的双顺反子微型基因组。同时,构建基于CMV启动子表达盒及密码子优化的辅助蛋白质粒系统,Western blot鉴定辅助蛋白质粒的蛋白表达,并与之前构建的基于T7启动子表达盒的辅助蛋白质粒比较拯救微型基因组的效率。将以EGFP或Gluc为报告基因的单/双顺反子微型基因组分别与辅助蛋白质粒共转染至BHK-T7细胞,通过荧光显微镜观察EGFP的表达、Gluc检测试剂盒分析Gluc的表达,以及RT-qPCR对EGFP mRNA水平进行检测,以实现对微型基因组的拯救及验证RSV四种辅助蛋白在拯救过程中的作用。结果：构建了以EGFP或Gluc为报告基因的单/双顺反子微型基因组及其编码质粒,以及基于CMV启动子表达盒及密码子优化的辅助蛋白质粒系统。成功拯救了携带EGFP或Gluc报告基因的单/双顺反子微型基因组,并验证了四种辅助蛋白在拯救过程中的生物学意义,其中M2-1具有抑制转录终止和促进亚基因组转录的生物学活性。研究也表明以CMV启动子表达盒和密码子优化为基础的辅助蛋白质粒较以T7启动子表达盒的辅助蛋白质粒拯救效率有所提高。结论：成功构建了编码可表达EGFP或Gluc报告基因的单/双顺反子微型基因组的重组质粒,并验证了四种辅助蛋白、尤其是M2-1蛋白在双顺反子微型基因组的拯救过程中具有转录延长的生物学活性,同时,发现以CMV启动子表达盒和密码子优化为基础的辅助蛋白质粒能高效进行拯救,适用于后续的RSV重组病毒拯救实验研究。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 微型基因组 双顺反子 辅助蛋白 密码子优化
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373.14
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 1 引言12-16
• 2 实验材料16-21
• 2.1 细胞、质粒和感受态细胞16
• 2.2 工具酶、试剂盒和抗体16
• 2.3 实验耗材16-17
• 2.4 主要生化试剂17
• 2.5 主要实验仪器17-18
• 2.6 主要溶液配制18-21
• 3 实验方法21-41
• 3.1 细胞培养21
• 3.2 表达EGFP/GLuc的单顺反子RSV微型基因组的构建21-28
• 3.2.1 pBR322B载体的改造21-24
• 3.2.2 可表达EGFP的单顺反子微型基因组的构建及鉴定24-26
• 3.2.3 可表达Gluc的单顺反子微型基因组的构建及鉴定26-28
• 3.3 可表达EGFP/Gluc的双顺反子RSV微型基因组的构建28-31
• 3.3.1 可表达EGFP的双顺反子微型基因组的构建及鉴定28-29
• 3.3.2 可表达Gluc的双顺反子微型基因组的构建及鉴定29-30
• 3.3.3 可表达EGFP/Gluc的RSV单/双顺反子微型基因组的构建流程30-31
• 3.4 以CMV启动子为表达盒的辅助蛋白质粒的构建31-32
• 3.5 辅助蛋白质粒的蛋白表达鉴定32-34
• 3.5.1 pcDNA3.1-N-OPT、pcDNA3.1-P-OPT和pcDNA3.1-M2-1-OPT的蛋白表达鉴定32-33
• 3.5.2 pcDNA3.1-L-OPT的蛋白表达鉴定33-34
• 3.6 拯救RSV单/双顺反子微型基因组与报告基因表达的检测34-38
• 3.6.1 多质粒共转染拯救可表达EGFP的单/双顺反子微型基因组34-36
• 3.6.2 多质粒共转染拯救可表达Gluc的RSV单/双顺反子微型基因组36-38
• 3.7 RT-qPCR检测RSV-EGFP 双顺反子报告基因的转录水平38-40
• 3.7.1 转染细胞的总RNA的提取38
• 3.7.2 RT-PCR合成cDNA第一链38-39
• 3.7.3 qPCR定量检测报告基因的mRNA39-40
• 3.8 基于CMV启动子表达盒与T7启动子表达盒的辅助蛋白质粒拯救微型基因组效率的比较40-41
• 4 实验结果41-55
• 4.1 EGFP/Gluc的单/双顺反子的微型基因组质粒的构建和鉴定41-45
• 4.1.1 pBR322B载体的构建和鉴定41
• 4.1.2 EGFP/Gluc的单顺反子的微型基因组质粒的构建和鉴定41-43
• 4.1.3 EGFP/Gluc的双顺反子的微型基因组质粒的构建和鉴定43-45
• 4.2 以CMV启动子表达盒为基础的辅助蛋白质粒的构建和鉴定45-47
• 4.2.1 辅助蛋白质粒的构建和酶切鉴定45-46
• 4.2.2 辅助蛋白质粒的蛋白表达鉴定46-47
• 4.3 可表达EGFP的单/双顺反子微型基因组的拯救及荧光表达47-50
• 4.4 可表达Gluc的单/双顺反子微型基因组的拯救及荧光定量检测50-52
• 4.5 RT-qPCR定量检测EGFP mRNA水平52-53
• 4.6 以CMV启动子和T7启动子为表达盒的的辅助蛋白质粒拯救微型基因组效率的比较53-55
• 5 讨论55-58
• 6 结论58-59
• 参考文献59-61
• 附录61-62
• 作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果62-64
• 学位论文数据集64

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本文编号：709962