人诱导共刺激分子配体ICOSL单克隆抗体及ELISA试剂盒的研制及应用

发布时间：2017-08-21 03:04

  本文关键词：人诱导共刺激分子配体ICOSL单克隆抗体及ELISA试剂盒的研制及应用

  更多相关文章： ICOSL 单克隆抗体 ELISA 可溶性ICOSL 共刺激作用

【摘要】：T细胞活化需要双信号:第一信号是TCR(T cell receptor)识别抗原提呈细胞表面抗原肽-MHC复合物,第二信号是T细胞和抗原提呈细胞共刺激分子之间的互相作用,共同决定T细胞的活化增殖,维持并调节活化级联反应,抑或转变为无反应状态甚至凋亡。正性共刺激分子ICOS(inducible costimulator)与其配体ICOSL(inducible costimulator ligand)相互作用后能有效地促进T细胞的增殖、活化和细胞因子的分泌等,还会参与Tfh(T follicular helper cells)增殖分化和生发中心反应,从而对B细胞分泌抗体发挥作用。同时ICOS/ICOSL信号通路在自身免疫性疾病、移植免疫、肿瘤免疫乃至感染性免疫的发生发展过程中具有重要的生物学功能。正性共刺激分子ICOSL以两种形式存在:可溶型和膜型。膜型ICOSL分子一定程度表达在活化的B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和部分T细胞亚群,也可诱导表达于血管内皮细胞、上皮细胞或成纤维细胞上。ICOSL与其表达在T细胞上的受体ICOS结合,可以不依赖于B7/CD28通路作用于T细胞发挥功能。ICOS分子胞内段含有一个“YMFM”基序,可与PI3K结合发挥其激酶活性,作用于下游信号通路,即ICOS/ICOSL信号途径会激活T细胞内依赖PI3K的信号途径。一般情况下可溶性共刺激分子可以通过专一的mRNA编码经免疫细胞直接分泌产生,也可以由膜型分子经蛋白水解酶(如基质金属蛋白酶等)的裂解而形成。临床资料分析显示,部分可溶性共刺激分子具有临床诊断的价值,然而机体中是否存在可溶性ICOSL,它是通过何种机制产生的,表达特性如何,在对膜型ICOS/ICOSL的调节作用中扮演何种角色,在临床疾病的免疫病理中发挥何种生物学作用等,这些问题还有待研究。因此,ICOS/ICOSL信号通路对T细胞在免疫应答中的调节发挥重要的生物学作用。通过研究ICOS/ICOSL的表达及其介导的信号通路与临床疾病的关系,阐明其在免疫病理中的作用和机理,可以为某些疾病的免疫诊断和免疫治疗寻求新的途径。本课题研究旨在构建转基因细胞L929/ICOSL的基础上,研制出特异性的鼠抗人ICOSL单克隆抗体,同时分析其生物学特性,进一步探究单抗对ICOS/ICOSL途径的调节作用和对T细胞增殖及其细胞因子分泌的影响;并应用所得单抗研制特异性检测人可溶性icosl(sicosl)的elisa试剂盒,对试剂盒的精确性和稳定性进行评价;利用研制的elisa试剂盒检测健康志愿者和系统性红斑狼疮患者外周血可溶性icosl的表达水平,探究sicosl可能的产生机制,进而探讨该可溶性因子在系统性红斑狼疮免疫病理中的临床意义。上述研究结果为阐明膜型icosl和可溶型icosl的生物学意义及icos/icosl在自身免疫性疾病中的作用提供了新的线索。一、鼠抗人icosl单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究【目的】研制特异性鼠抗人icosl单克隆抗体,为探究人icosl分子在不同细胞上或多种疾病中的表达奠定物质基础,并为探讨icos/icosl信号通路的生物学意义提供物质材料。【方法】以高表达人icosl分子的转基因细胞l929/icosl免疫balb/c小鼠,采用杂交瘤细胞融合技术将骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾脏细胞进行融合,运用流式细胞术对杂交瘤细胞的培养上清进行初筛,将合格的杂交瘤细胞株反复检测和亚克隆,成功获得两株特异性好且能够持续稳定分泌鼠抗人icosl单抗的杂交瘤细胞株;采取cba法和快速定性试纸法鉴定抗体亚型;通过westernblot、dotblot、细胞免疫荧光技术和elisa以及两株单抗之间或单抗与蛋白之间的竞争结合抑制实验分析所得单抗的生物学特性;用流式细胞术和间接免疫荧光分析icosl在多种肿瘤细胞表面的表达水平;研究所得单抗在人t细胞体外增殖实验中的生物学功能。【结果】1、成功获得两株稳定分泌特异性鼠抗人icosl单克隆抗体的杂交瘤细胞株:13d11和20b10。这两株单抗可用于流式细胞术、westernblot、dotblot、elisa、细胞免疫荧光技术的检测分析;2、竞争抑制实验表明,两株单抗识别icosl分子不同的抗原表位,且都与商品化单抗2d3不同;两株单抗均能有效阻断icos/icosl的结合;3、t细胞体外增殖实验结果表明,单克隆抗体13d11可抑制活化t细胞的体外增殖,且其抑制作用随单抗浓度的增加而增强。【结论】成功获得两株特异性鼠抗人icosl单克隆抗体,两者识别icosl不同的抗原表位,为研制检测人可溶性icosl的elisa试剂盒,进一步用来测定可溶性icosl的表达水平奠定了良好的物质基础;也为分析膜型icosl的表达特性,探讨icos/icosl信号通路对免疫系统的调节及其生物学功能提供必要的物质材料。二、特异性检测人可溶性icosl蛋白elisa试剂盒的研制【目的】研制稳定灵敏的特异性检测人sicosl的elisa试剂盒,为定量分析临床来源的标本和研究可溶性icosl的生物学意义提供有潜在应用价值的检测试剂。【方法】运用anti-icoslmab(20b10)作为包被抗体,在包被液(即碳酸盐缓冲液)中包被elisa板,4℃避光过夜,biotin-anti-icoslmab(2b4)作为检测抗体,识别已与20b10相结合的抗原,再加入streptavidin-hrp反应,最后用tmb底物显色,即双抗体夹心法建立sicosl的elisa检测体系。利用同一次实验多孔检测的方法分析试剂盒的精确性,利用同一次实验elisa板的不同测定时间的准确性分析试剂盒稳定性。【结果】建立稳定、灵敏的特异性检测人sicosl的elisa试剂盒,且试剂盒能特异性测定人sicosl,而不识别其他蛋白,试剂盒的标准曲线在sicosl蛋白0.156~10ng/ml的范围内表现出良好的线性关系。这种方法有良好的精确性和稳定性,离散度(cv%)分别为10.9%和3.65%。【结论】研制出特异性检测人sicosl的elisa试剂盒,为定量分析可溶性icosl的生物学功能和临床价值提供了有效的检测手段。三、可溶性icosl的表达特性及其在系统性红斑狼疮中的临床意义【目的】检测健康人外周血中sicosl的表达水平,揭示机体sicosl的产生机制,探讨sicosl在系统性红斑狼疮(sle)患者外周血异常表达的临床意义。【方法】应用第二部分研制的特异性检测人sicosl的elisa试剂盒分析各年龄层健康志愿者外周血中sicosl的表达特性;在高表达可溶性icosl的l929/icosl细胞培养液中加入金属蛋白酶抑制剂(mmpi),设空白对照,在不同时间点分析sicosl的表达水平;人淋巴细胞分离液(ficoll)加磁珠分选获得cd14+单核细胞和cd19+b细胞,加入mmpi,同时设空白对照,体外刺激活化后,运用elisa和流式检测可溶型和膜型icosl的表达水平,elisa检测培养上清中可溶性mmp-2和mmp-9的表达水平。流式检测45例系统性红斑狼疮患者和39例健康志愿者(healthycontrol,hc)外周血cd4+、cd8+t细胞表面icos及cd14+单核细胞、cd19+b细胞表面icosl的表达特性;利用自主研制的sicoslelisa试剂盒分析血浆可溶性icosl的表达。用统计学软件将测得的数据与临床各项指标作相关性分析,评价其临床意义。【结果】1、elisa检测结果显示,sicosl存在于人外周血中,且表达水平与年龄、性别有一定的相关性;2、基质金属蛋白酶抑制剂(mmpi)能抑制l929/icosl转基因细胞或过度活化的cd14+单核细胞和cd19+b细胞培养上清中sicosl的表达,且与对照组相比,实验组mmp-2和mmp-9的表达下调;3、与健康对照(hc)相比,sle患者外周血cd4+、cd8+t细胞表面icos的表达均显著升高(19.07±1.74)%vs(13.99±1.54)%、(10.04±0.99)%vs(6.36±0.99)%,且差异有统计学意义(p0.05),cd14+单核细胞上icosl的表达高于健康对照[(2.94±0.88)%vs(0.89±0.21)%,(p=0.04)],且与患者血浆c3和c4水平呈正相关[(r=0.40,p=0.031),(r=0.44,p=0.017)]。活动期组sle患者血浆sicosl的浓度显著高于非活动期组[(361.5±25.28)(ng/ml)vs(278±14.75)(ng/ml),(p=0.025)],且与cd14+单核细胞和cd19+b细胞表面icosl的表达均呈负相关[(r=-0.4243,p=0.022)、(r=-0.4099,p=0.025)]。【结论】人外周血中存在可溶性icosl,且mmp是其可能的产生机制之一。sle患者外周血淋巴细胞表面icos和icosl以及血浆sicosl表达水平显著增加,且与疾病活动度密切相关。提示icos/icosl途径可能参与sle免疫病理过程。综上所述,本研究获得以下结果:(1)研制出2株鼠抗人icosl单克隆抗体,可用于流式细胞术、westernblot、dotblot和elisa等研究;功能性鼠抗人icosl单抗13d11能抑制icos/icosl介导的t细胞增殖及细胞因子的分泌。(2)建立了特异性检测人sicosl的elisa方法,而且这个方法具有良好的精确性和稳定性。(3)利用研制的sicoslelisa试剂盒分析表明,健康人外周血中存在sicosl,且金属蛋白酶(MMPs)剪切机制是s ICOSL的产生机制之一;SLE患者外周血淋巴细胞表面ICOS和ICOSL及血浆sICOSL均表达异常,并且与疾病活动度密切相关,表明ICOS/ICOSL途径可能参与SLE免疫病理进程。
【关键词】：ICOSL 单克隆抗体 ELISA 可溶性ICOSL 共刺激作用
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392.11
【目录】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-15
• 研究背景15-27
• 一、ICOSL的分子结构与表达特性15-16
• 二、ICOSL的免疫学作用及作用机制16-18
• 三、ICOSL与疾病18-21
• 四、鼠抗人ICOSL单克隆抗体研制的应用前景21-22
• 五、可溶性共刺激分子在免疫应答中的作用22-23
• 参考文献23-27
• 第一部分 鼠抗人ICOSL单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究27-44
• 1 主要试剂与材料28
• 2 方法28-33
• 3 结果33-39
• 4 讨论39-41
• 参考文献41-44
• 第二部分 特异性检测人可溶性ICOSL蛋白ELISA试剂盒的研制44-52
• 1 主要试剂与材料44-45
• 2 方法45-46
• 3 结果46-49
• 4 讨论49-50
• 参考文献50-52
• 第三部分 可溶性ICOSL的表达特性及其在系统性红斑狼疮中的临床意义52-66
• 1 主要试剂与材料53
• 2 方法53-55
• 3 结果55-61
• 4 讨论61-63
• 参考文献63-66
• 结论与展望66-68
• 缩写词表68-70
• 攻读学位期间公开发表的论文70-71
• 本课题获得的基金资助71-72
• 致谢72-74

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张学平;陈晓萍;张萍;杜刚;;利用用空的试剂盒节约试剂的方法[J];实用医技杂志;2008年24期

2 陶步志;试剂温度对半自动生化分析仪酶学测定的影响[J];现代中西医结合杂志;2000年14期

3 柯江维,杨军平,黄蓉;试剂预温对半自动生化分析仪酶学测定的影响[J];江西医学检验;2001年04期

4 孙玉芬,秦国天;国产ELISA试剂盒批间变异的分析[J];现代医药卫生;2003年07期

5 张学平,杜刚,阿依古力,郭忠良,潘旭英,葛霞;一种在全自动生化分析仪上节约试剂的方法[J];现代检验医学杂志;2003年06期

6 于雷;二氧化碳(干粉)试剂盒的使用方法[J];现代检验医学杂志;2004年01期

7 李勇,胡望平,朱忠勇;国产自动化电泳试剂盒研制初探[J];现代检验医学杂志;2004年02期

8 赵勇,耿素敏,安国瑞;试剂盒批间差及盒间差的评价[J];实用医技杂志;2004年17期

9 赵驻军,李亚,张翠欣;如何将限量试剂盒中的残液用完[J];现代检验医学杂志;2005年05期

10 袁华;刘泽霞;;ELISA试剂盒底色较深的室间控制探讨[J];江苏预防医学;2006年01期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 徐文波;山德生;冯磊;;临床检验试剂盒的选择和质量评估[A];玉溪市第八届检验医学学术年会暨科技成果推广会论文汇编[C];2005年

2 王群;;调整加样秩序,延长试剂使用时间[A];全国血栓/止血与微循环学术会议论文汇编[C];2006年

3 刘华;王蕾;高锋;;国产抗环瓜氨酸肽抗体试剂盒的应用评估[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

4 陈国强;陈雷;张敬友;张睿;蒋原;石建华;朱娜;范红结;;猴痘病毒PCR检测试剂盒的研制及应用[A];第十届中国实验动物科学年会论文集[C];2012年

5 仇钰;孙谦;秦爱建;金文杰;邵红霞;顾炳泉;;检测马冠状病毒抗体的ELISA试剂盒研制[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集（2008）[C];2008年

6 邵文琦;宋斌斌;郭玮;潘柏申;;乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)国产ELISA试剂盒评价[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

7 徐万洲;李艳;汪明;吴青;吴泽刚;;四种检测HBsAg ELISA试剂盒诊断性能的比较[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年

8 付光宇;范冬冬;;血清前列腺特异性抗原化学发光免疫分析试剂盒的建立和初步应用[A];第五届全国光生物学学术讨论会论文摘要集[C];2000年

9 马岳;;LX-20两年工作体会[A];2004年浙江省检验医学学术会议论文汇编[C];2004年

10 刘忠民;张婷;冯健明;郑贵星;;胰岛素时间分辨荧光免疫分析试剂盒的研制及评价[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 樊小业;诊断试剂市场硝烟乍起[N];医药经济报;2003年

2 记者 罗朝淑;我科研用试剂研发取得阶段性成果[N];科技日报;2014年

3 本报记者 罗朝淑;国产科研用试剂：想说爱你不容易[N];科技日报;2014年

4 早报记者 俞立严;上海试剂盒已向非洲售出2000人份[N];东方早报;2014年

5 周明邋陈光;万泰药业 诊断试剂领军者[N];中国证券报;2008年

6 彭建军;首个商品化食品检测试剂盒评价程序启动[N];中国食品安全报;2011年

7 见习记者 郑莹莹;检测试剂盒的国产机遇[N];医药经济报;2014年

8 美通;Medical Services开始在中国生产[N];医药经济报;2004年

9 记者 赖文忠　实习生 黄琼芬;国内首个商品化食品检测试剂盒评价程序在闽启动[N];福建日报;2011年

10 记者 李江涛;“滴血”测癌试剂盒问世[N];新华每日电讯;2013年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 董志宁;乙型肝炎病毒表面抗原光激化学发光免疫测定试剂及人类免疫缺陷病毒时间分辨荧光免疫检测试剂的研制[D];南方医科大学;2012年

2 刘利军;HBV核酸定量检测试剂盒的研发及T细胞免疫水平的研究[D];内蒙古农业大学;2013年

3 杨怀宁;GICA一步法检测HIV和TP诊断试剂的研究[D];吉林大学;2008年

4 李红霞;结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELISA检测试剂盒的初步研究[D];四川大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 杨莹莹;猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立[D];东北林业大学;2015年

2 罗艳容;β- 人绒毛膜促性腺激素定量检测试剂盒的开发[D];郑州大学;2015年

3 刘雪杰;牛奶中抗生素残留检测指示菌的筛选鉴定及检测试剂盒研发[D];福州大学;2013年

4 胡筱涵;人诱导共刺激分子配体ICOSL单克隆抗体及ELISA试剂盒的研制及应用[D];苏州大学;2016年

5 杨红云;细菌性阴道病干化学酶法联合试剂盒的研制与性能评估[D];郑州大学;2016年

6 潘盛;禽传染性支气管炎病毒一步法RT-PCR检测试剂盒的研制及应用[D];四川农业大学;2006年

7 蔡鹃;分泌型免疫球蛋白A-ELISA检测试剂盒的研制及临床应用研究[D];北京协和医学院;2011年

8 王华忠;基于血糖血脂和肝功同步快速检测的干试剂研究[D];第三军医大学;2007年

9 曹娅;人复制蛋白变体胶乳增强免疫检测试剂盒的研制[D];南京大学;2015年

10 贺安;癌胚抗原和神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析试剂的研制[D];南方医科大学;2011年

，

本文编号：710433