生物素AP-tagged-FOXMl的表达体系构建及蛋白互作初探

发布时间：2017-08-23 01:21

  本文关键词：生物素AP-tagged-FOXMl的表达体系构建及蛋白互作初探

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【摘要】：生物素AP-tag技术是指在目的蛋白的N端或C端加上由15个氨基酸(GLND IFEAQKIEWHE)组成的受体肽(acceptor peptide, AP)小标签,该小标签可被生物素连接酶BirA特异性识别,BirA酶可催化生物素转移到靶标蛋白标签上的赖氨酸残基上,导致带有标签的靶标蛋白在体内或体外都能被生物素化。该生物素化过程为酶促反应,反应条件相当温和而且标记的专一性极高。生物素AP-tag技术具有高效、位点特异及操作方便等特点,同时由于序列短小,对靶标蛋白的构象及活性影响极低。链霉亲和素可以专一地与生物素结合,且两者间的结合力是自然界已知的最强的非共价结合作用力,结合常数Kd值高达10-15mol/L,比抗原与抗体间的结合力高1万倍。因此,可在严格的洗脱条件下分离出目标蛋白及其蛋白特异性相互作用的复合物。FOXM1是Forkhead box转录因子家族的成员之一,它与细胞增殖、衰老、DNA损伤修复、再生和肿瘤等许多生理病理过程都有密切关系。本课题构建基于生物素AP-tag的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pcDNA-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶BirA真核表达载体pcDNA-BirA,将pcDNA-AP-FOXM1和pcDNA-BirA共转染人胚肾293T细胞,使用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的FOXM1,通过银染及Western印迹检测细胞裂解液以及亲和纯化后的蛋白复合物,确定了相关蛋白表达情况。研究发现AP-FOXM1在HEK293T细胞中被生物素化且该蛋白在Western印迹、pull down等实验中可实现无需抗体的一步法应用。另外,分别构建了的pcDNA-AP-FOXM1 (1-224aa)和pcDNA-AP-FOXM1(1-353aa),在细胞内表达不同长度的可生物素化的FOXM1,并验证了FOXM1的互作蛋白p-catenin与FOXM1的C端发生互作,为研究FOXM1与其他蛋白的细节互作关系提供了有效工具。
【关键词】：生物素AP-tag FOXM1 BirA酶 亲和纯化 蛋白互作
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-21
• 1.1 生物素AP-tag技术概述10-11
• 1.2 生物素连接酶BirA的简介11-13
• 1.2.1 生物素简介11-12
• 1.2.2 生物素连接酶BirA概述12
• 1.2.3 BirA酶的结构12-13
• 1.2.4 BirA酶的功能13
• 1.3 链霉亲和素简介13-14
• 1.4 转录因子FOXM1的概述14-17
• 1.4.1 转录因子FOXM1的结构14
• 1.4.2 转录因子FOXM1的功能14-17
• 1.5 β-catenin的概述17
• 1.6 FOXM1蛋白互作概述17-18
• 1.7 研究目的、内容与意义18-21
• 第2章 生物素化FOXM1真核表达体系的构建21-36
• 2.1 前言21
• 2.2 实验材料与仪器21-23
• 2.3 实验方法23-32
• 2.3.1 BirA酶重组表达质粒的构建23-29
• 2.3.2 生物素化FOXM1重组表达质粒的构建29-32
• 2.4 结果与分析32-35
• 2.4.1 pcDNA-BirA重组表达载体的构建及鉴定32-33
• 2.4.2 pcDNA-AP-FOXM1重组表达载体的构建及鉴定33-35
• 2.5 本章小结35-36
• 第3章 AP-FOXM1的生物素化和纯化36-47
• 3.1 前言36
• 3.2 实验材料与仪器36-38
• 3.3 实验方法38-43
• 3.3.1 细胞培养38-39
• 3.3.2 质粒共转染实验39
• 3.3.3 蛋白免疫印迹法(Western Blot)39-42
• 3.3.4 蛋白纯化42
• 3.3.5 硝酸银染色42-43
• 3.4 结果与分析43-46
• 3.4.1 重组质粒在真核细胞中的表达及生物素化43-44
• 3.4.2 生物素化的AP-FOXM1一步纯化44-45
• 3.4.3 生物素化的FOXM1硝酸银染色分析45-46
• 3.5 本章小结46-47
• 第4章 生物素AP-tagged-FOXM1的蛋白互作初步研究47-57
• 4.1 前言47-48
• 4.2 实验材料与仪器48-50
• 4.3 实验方法50-54
• 4.3.1 pcDNA3.1-AP-FOXM1不同片段长度重组质粒的构建与鉴定50-53
• 4.3.2 质粒共转染实验53
• 4.3.3 蛋白免疫印迹法(Western Blot)53-54
• 4.3.4 蛋白纯化54
• 4.4 结果与分析54-56
• 4.4.1 pcDNA-AP-FOXM1不同片段长度重组表达载体的构建及鉴定54
• 4.4.2 基于生物素AP-tag技术的FOXM1的互作蛋白检测54-56
• 4.5 本章小结56-57
• 总结与展望57-59
• 参考文献59-65
• 附录A 英文缩写65-66
• 附录B 常用缓冲液和试剂配方66-67
• 附录C 攻读硕士学位期间发表的论文目录67-68
• 致谢68

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本文编号：722181