差速贴壁法分离兔骨髓源性间充质干细胞和内皮祖细胞及其生物学特性的研究

发布时间：2017-08-28 03:05

  本文关键词：差速贴壁法分离兔骨髓源性间充质干细胞和内皮祖细胞及其生物学特性的研究

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【摘要】：本研究探讨一种高效、稳定的从兔骨髓中同时分离培养间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)和内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)的方法并观察其生物学特性。抽取兔骨髓,应用密度梯度分离单个核细胞,采用差速贴壁经纤连蛋白包被并结合EGM-2MV培养基分别扩增MSC和EPC。用台盼蓝法测定细胞传代成活率,通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测MSC和EPC的增殖能力及诱导分化成骨细胞、成脂肪细胞能力,并结合流式细胞术(FCM)检测MSC免疫原型以鉴定MSC;细胞吞噬功能特异性地摄取Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1,并结合CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光鉴定EPC,并计算其纯度。结果表明,经密度梯度分离单个核细胞,在早期贴壁细胞24 h换液时即可见明显集落形成,8 d后达80%融合,细胞呈均匀一致的长梭形排列;2次贴壁细胞经EGM-2MV培养基培养,第3天开始伸展,约8 d可融合近80%,细胞呈多角形,出现条索状结构;2种细胞台盼蓝法测定细胞传代成活率均在90%以上,传至第2代后,生长曲线均近似"S"形;MTT法检测显示,细胞生长d 3至d 5时光密度值变化较明显;MSC G0-G1期为(93.32±1.65)%、EPC G0-G1为(93.05±1.95)%,2种细胞DNA周期无明显差异;早期贴壁细胞FCM检测CD90、CD44阳性率为(99.7±1.12)%、(99.1±2.33)%;CD14、CD45、CD79a阳性率分别为(4.8±0.38)%、(6.8±0.49)%及(0.4±0.08)%,经体外诱导能够向成骨细胞及脂肪细胞分化,鉴定为MSC;2次贴壁细胞传至第2代经Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(82.1±3.4)%,CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光染色阳性率分别为(74.2±3.2)%、(64.7±4.3)%及(43.5±1.5)%,鉴定为EPC。结论:应用密度梯度分离法结合差速贴壁筛选法可培养出高纯度的MSC,2次贴壁细胞经纤连蛋白预包被并结合EGM-2MV培养基体外诱导可培养出增殖能力较强的EPC,为组织工程学研究提供种子细胞。
【作者单位】： 首都医科大学附属北京安贞医院;北京市心肺血管疾病研究所分子生物学研究室;
【关键词】： 差速贴壁法 骨髓 间充质干细胞 内皮祖细胞 细胞培养 生物学特性
【基金】：国家自然科学基金资助项目(编号81170283) 北京市自然科学基金项目(编号7072012) 省部共建重点教育部心血管重塑相关疾病重点实验室(编号110267) 首都医科大学基础-临床合作基金重点课题(编号11JL09)
【分类号】：R329.28
【正文快照】： 骨髓中含有丰富的成体干细胞,如间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)、内皮祖细胞(EPC)等,因此成体干细胞是一类具有定向分化和自我更新潜能的细胞,其临床应用前景较为广阔,使其成为近年来生命科学研究的热点[1,2]。国内学者蒋晶晶等[3]、杨宇辉等[4]对大鼠及小鼠骨髓中同时

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