阿尔茨海默病中microRNA29c对APP、BACE1蛋白的负性表达调控

发布时间：2023-03-12 22:22

　　阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是老年人最常见的中枢神经系统退行性疾病。1907年由德国精神科医生Alois Alzheimer首先提出并以他的名字命名。临床表现为隐袭起病,逐渐出现记忆力减退、认知功能障碍、行为异常和社交障碍。病情呈进行性加重,逐渐丧失独立生活能力,发病后10-20年因并发症而死亡。AD可分为家族性(FAD)和散发性或迟发性(SAD/LOAD).主要三大病理变化是神经细胞外老年斑沉积、神经元内神经纤维缠结和神经元缺失等。阿尔茨海默病的发病机制尚未完全明确。四个突变基因在AD中起重要作用,APP、PS1、PS2家族性AD中发现的3个基因,及一个在散发性AD中的危险因素基因ApoE。目前,虽然在基因水平对家族性阿尔茨海默病已经有了深入地了解。但是,我们对AD从基因突变到Aβ沉积、神经原纤维缠结、神经元丢失、神经突触可塑性改变、记忆学习能力缺失等病理发生机制并不了解。Aβ、Tau、PS和ApoE等均在AD的发病过程中起到重要作用,但以上述几个方面做为靶点的治疗未能取得令人满意的效果。因此,从新的角度来研究AD的发病机制,从而为其治疗提供新的思路是十...

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【学位级别】：博士

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中文摘要
ABSTRACT
前言
    阿尔茨海默病研究进展
        β淀粉样蛋白学说
        AD相关基因学说
        胆固醇代谢与Aβ蛋白、PS
    microRNA研究进展
        microRNA与标靶
        microRNA的预测
        microRNA与疾病
        microRNA与神经系统
第一部分 APPswe/PS1ΔE9双转基因阿尔茨海默病小鼠模型分析
    (一) 材料
        1 实验动物
        2 主要生化试剂
        3 主要仪器设备
        4 主要溶液配置
    (二) 实验方法
        1 动物分组及实验设计
        2 转基因阳性鼠的PCR鼠尾鉴定
    (三) 实验结果
    (四) 讨论
第二部分 microRNA在阿尔茨海默病中的作用研究
    (一) 材料
        1 实验动物
        2 主要生化试剂
        3 主要溶液配置
        4 主要仪器设备
    (二) 实验方法
        1 动物分组
        2 microRNA芯片
        3 Ambion RNA提取试剂盒提取小鼠组织或细胞富含miRNA的总RNA
        4 逆转录PCR(RT-PCR)
        5 real-time PCR检测APPSWE/PS1ΔE9双转基因AD小鼠模型大脑皮层及海马中microRNA的表达水平变化
        6 has-miR-29C表达质粒的构建
        7 质粒转化Top10感受态细胞
        8 转化后菌落的插入片段阳性克隆快速鉴定
        9 质粒DNA的小量提取
        10 菌液小提鉴定阳性克隆
        11 SH-SY5Y细胞的Blasticidine药物浓度筛选
        12 has-miR-29C质粒稳定转染SH-SY5Y细胞
        13 hAPPcDNA质粒与has-miR-29C质粒共同瞬时转染
        14 hsa miR-29C靶基因的预测
        15 免疫印迹(Western blot)
        16 SDS-PAGE凝胶电泳
        17 real time PCR检测靶基因mRNA表达水平
        18. 构建APP、NAV3 3’UTR荧光素酶报告载体
        19. 带有APP、NAV3 mRNA 3’UTR的psiCHECK-2荧光素酶报告基因载体与miR-29c表达载体共转染实验
        20. 双荧光素酶报告检测实验
    (三)实验结果
        1、microRNA芯片检测结果
        2、APPSWE/PS1ΔE9双转基因小鼠及野生小鼠提取RNA结果
        3 real-time PCR结果
        4. 质粒转化Top10感受态细胞
        5. SH-SY5Y细胞的Blasticidine药物浓度筛选
        6. has miR-29C质粒稳定转染SH-SY5Y细胞
        7. has-miR-29c靶基因的预测
        8. Western blot检测预测靶蛋白表达情况
        9. real time PCR检测靶基因mRNA表达水平
        10. Western blot检测APPSWE/PS1ΔE9双转基因小鼠中APP、BACE1、NAV3蛋白预测靶蛋白表达情况
        11 hAPPcDNA质粒与has-miR-29c质粒共同瞬时转染
        12 hBACE1质粒与has-miR-29C质粒共同瞬时转染
        13 hPI15质粒与has-miR-29C质粒共同瞬时转染
        14. 构建了APP、NAV3 mRNA的3’UTR荧光素酶报告载体
        15. 构建了APP mRNA的2个突变3’UTR荧光素酶报告载体
        16. 带有APP3’UTR的psiCHECK-2荧光素酶报告基因载体与miR-29c表达载体共转染实验
        17. APP突变3’UTR的psiCHECK-2荧光素酶报告基因载体与miR-29c表达载体共转染实验
        18 带有NAV3 3’UTR的psiCHECK-2荧光素酶报告基因载体与miR-29c表达载体共转染实验
    (四) 讨论
        microRNA29c对APP蛋白的表达调控
        microRNA29c对BACE1蛋白的负性表达调控
        microRNA29c对NAV3基因的调控
        microRNA研究技术
第三部分 miRNA29c转基因小鼠的建立和分析
    (一) 实验方法
        1. Has-miR-29c转基因小鼠的制备
        2. 转基因阳性鼠基因型的PCR鼠尾鉴定
        3. Realtime PCR检测miR-29c转基因阳性小鼠的表达情况
        4. westyon blot检测miR-92c转基因阳性小鼠靶蛋白的表达情况
    (二) 结果
        1. Has-miR-29c转基因小鼠的制备
        2 PCR鉴定miR-29c转基因阳性小鼠结果
        3. Realtime PCR检测miR-29c转基因阳性小鼠的表达情况
        4. western blot检测miR-29c转基因阳性小鼠靶蛋白的表达情况
讨论
结论
参考文献
附录
英文缩略词表
致谢



本文编号：3762051