防风提取物联合三氧化二砷对急、慢性髓系白血病体内外实验研究

发布时间：2017-04-15 12:05

  本文关键词：防风提取物联合三氧化二砷对急、慢性髓系白血病体内外实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：以人急世髓系白血病细胞株HL-60和人性性随系白血病细胞株K562为实验对象,探讨ATO及防风提取物对该细胞株生长的影响。检测防风提取物单独与联合ATO后对HL-60、K562细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其分子机制。建立NOD/SCID-AML小鼠模型,通过体内实验验证防风提取物对ATO的减毒增效作用。方法：1.防风提取物抑制HL-60、K562细胞增殖的作用研究不同剂量防风提取物(1500、1250、1000、750、500、250μg/ml)作用于HL-60和K562细胞株48h。MTT法检测防风提取物对HL-60、K562细胞增殖的影响并计算出防风提取物对HL-60、K562细胞的半数抑制浓度；倒置显微镜观察细胞形态学变化。2.防风提取物联合ATO对HL-60、K562增殖、凋亡的影响采用HL-60和K562两种细胞株,分为空白对照组、防风提取物组、ATO组、防风提取物联合ATO组。MTT法检测HL-60、K562细胞增殖变化；流式细胞仪检测HL-60、K562细胞凋亡率和细胞周期分布。3.建立NOD/SCID-AML小鼠模型NOD/SCID小鼠,雄性,3-4周龄,适应性饲养1周,随机分为A、B、C、D、E、F、G7组。A、B、C组小鼠接种肿瘤细胞前给予300 cGy60Co照射(照射剂量率为116 cGy/min),照射后24h内尾静脉注射对数生长期HL-60细胞(A组：1×107/只；B组：5×106/只：C组：3×106/只)。D、E、F组小鼠无预处理,直接尾静脉注射对数生长期HL-60细胞(D组：1×107/只；E组：5×106/只；F组：3×106/只)。G组小鼠不做处理为正常对照组。日常观察小鼠的发病和身体浅表部位肿瘤生长情况；通过流式细胞仪分析外周血、肝脾组织和骨髓中HL-60细胞比例；取濒死小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、骨髓及肿瘤组织,进行组织病理学和细胞学检查,综合判断模型是否建立成功。4.基于NOD/SCID-AML小鼠模型,观察防风提取物减毒增效功能的实验研究建模：4-5周龄NOD/SCID小鼠尾静脉注射1×107的HL-60细胞,定期检查小鼠外周血细胞形态,流式细胞仪检测小鼠外周血中CD33阳性率,确定模型建立成功。分组：建模后的小鼠随机分为4组：模型组(不给予药物治疗)、单用防风提取物组(500mg/kg灌胃×15d)、单用ATO组(3mg/kgATO腹腔注射×15d)、防风提取物联合ATO组(500mg/kg防风提取物灌胃+3mg/kg ATO腹腔注射×15d),观察各组小鼠生存时间。实验后期,每组随机麻醉处死3只小鼠,采集主要脏器标本,观察脏器损伤情况。结果：1.防风提取物能够抑制K562、HL-60细胞增殖750,1000,1250,1500μg/ml防风提取物对K562细胞有明显的增殖抑制作用,48h的OD值与对照组比较有显著性差异(P0.05)：防风提取物6个浓度组对HL-60细胞有明显增殖抑制作用,48h的OD值与对照组比较有显著性差异(P0.05),其抑制增殖的作用呈剂量依赖性。2.防风提取物能够增强ATO对K562、HL-60细胞增殖的抑制作用防风提取物与ATO具有协同抑制HL-60、K562细胞生长的作用,这种协同抑制作用随着防风提取物浓度的增加而增强；防风提取物分别与500,250μg/ml联用对K562细胞的凋亡率与空白对照组或ATO组相比显1μg/ml、2μg/ml ATO著升高防风提取物分别与(P0.05); 500、250μg/ml联用对1、0.5μg/ml ATOHL-60细胞的凋亡率与空白对照组或ATO组相比显著升高(P0.05)；2、1、0.5作用48h后,与空白对照组相比,K562细胞G2-M期比例升高、G0-G1μg/ml ATO期细胞比例降低；HL-60细胞Go-G1期、G2-M期细胞比例升高、S期细胞比例降低。两药联用后K562细胞S期细胞比例与空白对照组或单用ATO组升高；HL-60细胞周期的变化不规律,凋亡细胞比例与空白对照组或ATO组相比显著升高(P0.05)并呈现出剂量依赖性。小鼠模型建立成功3. NOD/SCID-AML造模10d左右,小鼠外周血涂片中可检测到HL-60细胞；28d左右,部分小鼠出现后肢瘫痪的症状；35d左右,部分小鼠身体浅表部位出现实体瘤,各处理组小鼠全部发病,发病后期外周血、骨髓可检测到大量白血病细胞并浸润到肝、脾等脏器。40d左右,小鼠陆续死亡,60Co照射过的所有小鼠在52d内死亡,平均生存时间为(39.33±12.66)d；没有接受60Co照射的所有小鼠在64d内全部死亡,平均生存时间为(55.67±10.41)d,发病率为100%,证实NOD/SCID-AML小鼠模型建立成功。4.防风提取物联合ATO能够延长NOD/SCID-AML模型小鼠的生存时间联合用药组小鼠生存时间与模型组比较有显著性差异(P0.05),防风提取物组和ATO组无显著性差异。各治疗组小鼠生命延长率分别为：单用ATO组36%,单用防风组37.3%,联合用药组51.8%。主要脏器病理切片显示,与模型组相比,治疗组脏器病变有不同程度减轻,肾脏较明显。结论：1.防风提取物具有一定程度的抑制K562、HL-60细胞增殖的能力,其抑制作用呈浓度依赖性。2.防风提取物能够增强ATO对K562、HL-60细胞增殖的抑制作用。增强ATO对K562细胞的增殖抑制作用可能与协同ATO诱导K562细胞凋亡和S期细胞周期阻滞有关。增强ATO对HL-60细胞的增殖抑制作用可能与协同ATO诱导HL-60细胞凋亡有关。3.4-5周龄NOD/SCID小鼠尾静脉注射3×106～1×107个HL-60细胞,无论是否接受60Co照射均能表现出全身白血病症状。这种方法建立的白血病小鼠模型是国内外评价药物对白血病增殖、分化等作用机制研究的常用模型。4.防风提取物具有增强ATO对NOD/SCID-AML小鼠模型的治疗作用,并能改善小鼠脏器受损情况,该实验为防风协同ATO治疗白血病动物模型提供了新的实验依据。
【关键词】：三氧化二砷 防风提取物 急性髓系白血病 慢性髓系白血病 NOD/SCID小鼠
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 缩略语名词对照表13-14
• 文献综述14-21
• 前言21-22
• 第一章 防风提取物联合三氧化二砷对白血病细胞株K562/HL-60的增殖抑制及诱导凋亡作用22-39
• 1.1 实验材料22-23
• 1.1.1 细胞株22
• 1.1.2 主要药物与试剂22-23
• 1.1.3 仪器和设备23
• 1.2 实验方法23-26
• 1.2.1 细胞培养23
• 1.2.2 MTT法检测药物对白血病细胞的抑制率23-25
• 1.2.3 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率25-26
• 1.2.4 流式细胞术分析细胞周期分布26
• 1.2.5 统计分析26
• 1.3 实验结果26-37
• 1.3.1 MTT检测结果26-30
• 1.3.2 药物对细胞凋亡的影响30-35
• 1.3.3 药物对细胞增殖周期的影响35-37
• 1.4 讨论37-39
• 第二章 NOD/SCID-AML小鼠模型的建立方法39-56
• 2.1 实验材料39-40
• 2.1.1 主要试剂及耗材39-40
• 2.1.2 主要仪器40
• 2.1.3 细胞、小鼠40
• 2.2 实验方法40-43
• 2.2.1 配制HL-60细胞接种液40
• 2.2.2 实验动物模型的建立40-41
• 2.2.3 实验动物模型的鉴定41-43
• 2.3 结果43-54
• 2.3.1 发病情况43-45
• 2.3.2 流式细胞仪分析检测CD33阳性率45-47
• 2.3.3 组织病理学检查47-54
• 2.4 讨论54-56
• 第三章 防风提取物联合ATO对NOD/SCID-AML模型小鼠的治疗作用56-63
• 3.1 实验材料56-57
• 3.1.1 主要试剂及耗材56
• 3.1.2 主要仪器56-57
• 3.1.3 细胞、小鼠57
• 3.2 实验方法57
• 3.2.1 实验动物模型分组57
• 3.2.2 小鼠发病情况57
• 3.2.3 观察小鼠的一般情况及生存时间57
• 3.2.4 病理检查57
• 3.2.5 统计学分析57
• 3.3 实验结果57-61
• 3.3.1 小鼠发病情况57-58
• 3.3.2 实验各组白血病NOD/SCID小鼠生存时间58
• 3.3.3 实验各组白血病NOD/SCID小鼠主要脏器病理学检查58-61
• 3.4 讨论61-63
• 结论63-64
• 参考文献64-70
• 个人简历70-71
• 致谢71-72
• 附件72-77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：308344