体外兔软骨细胞的分离，培养与鉴定的研究

发布时间：2017-07-06 10:25

  本文关键词：体外兔软骨细胞的分离，培养与鉴定的研究

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【摘要】：背景骨性关节炎是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特性的慢性关节疾病,因关节软骨退化损伤导致关节边缘和软骨下骨反应性增生所致。是临床上多发的老年退行性疾病。随着我国的老龄化,骨性关节炎的发病率越来越高,该病造成的疼痛及活动不便严重影响老人们的生活作息。现今对该病的治疗仍然缺乏特效药,软骨的破坏过程中可能影响到软骨细胞,而导致软骨细胞分泌炎性细胞因子。研究表明再生软骨细胞移植能有效的解决软骨损伤,根治骨性关节炎。以前的传统方法较复杂繁琐,且容易污染,引起软骨细胞死亡、降低成活率和质量,因此寻找简单体外培养软骨细胞的方法对骨性关节炎的治疗非常重要。故本研究的目的是探讨体外软骨细胞的分离培养方法,以获取大量分裂活跃具有高活力的软骨细胞,修复软骨缺损,为软骨细胞成功移植、治愈骨关节炎提供理论基础。目的：在体外对兔软骨细胞的分离、培养以及试验鉴定,在体外建立软骨细胞培养的体系,培养出大量纯度高活性高的软骨细胞。为下一步的人工软骨再造及软骨移植奠定基础的理论研究。方法耳缘静脉麻醉新西兰大白兔,在兔子胸口解刨,暴露出心脏动脉,最大量取血,应用离心机制备高浓度血小板血浆,冰箱内封存,并防止污染,以备后期应用；无菌操作取出兔膝关节软骨,在超净台上分离关节组织,提取软骨组织,将其剪成lmmxlmm大小碎片,放入20 ml小烧杯中,PBS磷酸缓冲溶液冲洗3次,加入质量分数为0.1%的乙二胺四乙酸(EDTA)5ml置于常温下静止20分钟后离心弃上清,加入相当3倍体积的0.25%胰蛋白酶,放置37℃恒温振荡器内消化40 min,轻轻吹打弃去上清液,PBS冲洗2次,按照1：1比例加入质量分数为0.2%Ⅱ型胶原酶和质量分数为0.25%胰蛋白酶各5ml置于37℃恒温振荡器内消化20 min,4℃低温高速离心(1000r·min-1)5 min,离心后弃上清,加入6ml含0.2%Ⅱ型胶原酶消化液置于37℃恒温振荡器内进行消化,每90分钟取上清1次,剩余烧杯内更换消化液继续消化,取含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基于上清液中和胰蛋白酶,高速离心收集沉淀细胞,所收集细胞重悬于DMEM/F12培养液(含10%FBS、青链霉素各100μg/ml)中。应用机械-双酶消化法分离兔软骨细胞,体外培养时实验组加PRP,对照组常规培养,通过显微形态学观察两组细胞,运用Prism软件、MTT比色法绘制两组细胞增殖生长曲线。应用苏木素-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定软骨细胞,对比两组培养的软骨细胞的活性表达。结果改良后的机械-双酶分离法,在分离软骨细胞过程中,用时较传统方法明显缩短,在体外软骨细胞的培养过程中,加入激活后的富血小板血浆(PRP),能促进软骨细胞的分裂增殖,随传代次数增加后仍能具有较高的软骨细胞的生物学特性。结论本试验研究建立了较为简单、方便的体外软骨细胞分离方法,在培养过程中,加入激活后的PRP,能促进软骨细胞的活性表达,在体外获得大量的高纯度、高活性软骨细胞,这一结论为将来人工软骨再造和移植提供理论基础。
【关键词】：兔软骨细胞 细胞培养 富血小板血浆 软骨移植
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R684.3
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-10
• 材料和方法10-12
• 结果12-14
• 讨论14-19
• 结论19-20
• 附图20-23
• 参考文献23-26
• 综述：软骨移植在治疗骨性关节炎软骨损伤中的临床分析26-42
• 参考文献38-42
• 附录42-43
• 攻读学位期间发表文章情况43-44
• 致谢44-45
• 个人简历45

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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本文编号：525831