延迟应用不同剂量rhEPO治疗大鼠急性挤压性胸脊髓损伤

发布时间：2017-08-14 04:25

  本文关键词：延迟应用不同剂量rhEPO治疗大鼠急性挤压性胸脊髓损伤

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【摘要】：背景脊髓损伤是骨科较为常见的疾病,近年来随着经济社会的发展以及交通运输网络的不断扩张,意外事故的发生率逐年增加,脊髓损伤的发病率也有逐年升高的趋势。据报道,每年约有10000名患者经历创伤性脊氁损伤在美国,由于中国人口基础数是美国的数倍,所以我国每年发生创伤性脊髓损伤的患者应当远超10000人。对于脊髓损伤的患者来说,由于目前缺乏明显有效的治疗方法,其愈后往往不能获得令人满意的结果且治疗费用高昂,不同程度的增加了社会和家庭的经济负担。对于年轻人来说,一旦发生较严重的脊髓损伤,这就意味着一生无法独立自主的生活,给其身心造成巨大的影响。脊髓损伤的治疗开始于第二次世界大战在英格兰,随后在美国建成了多个脊髓损伤治疗中心。尽管经过几十年的发展及对脊髓损伤病因及治疗方法的研究,但是,对于如何降低由脊髓损伤引起患者的致残率以及如何提高脊髓损伤后的治愈率,目前仍然是一个世界性难题。目前常用的药物治疗了措施包括：神经节苷脂、脑源性神经营养因子、甲强龙等。单唾液酸神经节苷脂(GM-1 ganglioside)是正常细胞膜的重要组成部分,在哺乳动物中枢神经系统中含量非常丰富,特别是在突触中含量尤其高。先前的研究表明：细胞膜上的GM-1含量的变化,对调节神经元及细胞内外信息传递发挥着重要的作用。动物实验研究表明GM-1可以促进脊髓损伤的动物运动功能的恢复,其可能的作用机制包括：GM-1可以通过增强微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2, MAP-2)的表达来发挥保护脊髓损伤后的神经元,促进运动功能恢复的作用；通过增加bcl-2凋亡抑制基因的表达,在一定程度上减少细胞凋亡；通过稳定细胞内Ca2+平衡,减轻组织细胞水肿；降低脂质过氧化反应,降低兴奋性氨基酸EAA的毒性；促进神经再生等。先前一个关于GM-1神经节苷脂治疗脊髓损伤的的前瞻性、随机性、安慰剂对照、双盲的实验研究被Geisler等人实施,该研究共纳入37位患者,最后只有34位患者完成了实验：其中23位患者是颈椎脊髓损伤,11位患者是胸椎脊髓损伤；此外,每位患者接受治疗药物治疗的时间在损伤后72小时内,所有患者随访1年,通过Frankle评分量表和美国脊髓损伤相关运动功能评分量表(ASIS)对实验组和对照组患者进行评估,其研究发现单唾液酸神经节苷脂可以改善脊髓损伤患者的运动功能,但是,本实验样本量较少,尚不能够提供很强的临床证据来证明GM-1神经节苷脂对脊髓损伤的患者有明显的治疗作用,此外,GM-1价格较为昂贵,不是所有的家庭都能承担起长期的治疗费用,在一定程度上也限制了其应用。找到一种价格适中且治疗效果明确的药物尚需进一步大量的研究。脑源性神经营养因子(BDNF)具有保护损伤脊髓的作用,促进神经再生及修复,改善运动功能,而且,脊髓损伤后本身也会产生一定量的脑源性神经营养因子,但是分泌量极少。目前脑源性神经营养因子并没有很好的用于临床,主要是因为脑源性神经营养因子在血液中极容易被分解,在尚未通过血脑屏障前,绝大部分脑源性神经营养因子已被灭活,达不到治疗效应的药物浓度。尽管Liang等人报道了：给予急性脊髓损伤的大鼠行损伤段脊髓下埋管并通过该软管定期注射脑源性神经营养因子治疗并取得良好治疗结果,但是目前尚缺乏大规模临床试验结果,此外,即使损伤段脊髓下埋管给药治疗具有一定的作用,但是在临床应用上具有一定的难度,脊髓下埋管一方面需要极高的穿刺埋管技术,主要是避免加重脊髓损伤,另一方面是脊髓下埋管容易导致感染,需要极好的护理,一旦感染不仅会加重病情,甚至导致患者死亡,因此目前脑源性生长因子很难应用于临床,除非能够找到良好的运送载体。甲强龙(MP)是目前临床用于治疗急性脊髓损伤的首选方法,且必须在脊髓损伤后8小时内给药,否则治疗效果将大大降低。但大剂量MP的应用会造成许多严重的并发症,如胃肠道出血、肠穿孔、无菌性股骨头坏死、增加感染的机会等,目前许多临床治疗中心已不在将其作为脊髓损伤的首选治疗方法,甚至有些治疗中心彻底放弃这种治疗方法。目前的研究显示：与大剂量MP治疗相比,应用重组人促红细胞生成素(rhEPO)治疗大鼠急性脊髓损伤能够更好的改善其运动功能。促红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白和细胞因子,具有调节红细胞生成的作用,在成人主要由肾脏产生,而在胎儿主要由肝脏产生,且组织缺氧是诱导其产生的关键因素。rhEPO具有与EPO相似的生物学作用,目前在临床上被广泛用于治疗许多疾病,如慢性肾功能不全、肾性贫血、癌症、手术后治疗等。许多不同类型的脊髓损伤的动物实验模型已证实rhEPO具有保护急性胸脊髓损伤的作用,但在他们的实验中,实验动物获得rhEPO治疗在损伤后1小时内。先前的一个研究报道延迟应用rhEPO治疗(损伤后1小时给药)大鼠急性胸脊髓损伤缺乏神经保护效应。为了进一步观察延迟应用rhEPO治疗急性胸脊髓损伤是否具有神经保护,本实验通过应用大鼠急性挤压性胸脊髓损伤模型,比较对照组和不同剂量的实验组在损伤后2小时给药后的治疗效果,通过评估运动功能评分、组织病理评级、凋亡指数、炎症指数、脊髓超微结构评分及脱髓鞘面积。目的全面系统的评估延迟应用不同剂量的促红细胞生成素治疗大鼠急性挤压性胸脊髓损伤的神经保护作用。方法本实验将分为两个阶段进行,在第一阶段中,共有32只健康雄性SD大鼠,将其平均随机分为4组：对照组(A组,N=8)：按脊髓挤压的方法造模后,分别在术后2小时、1、3天给予腹腔注射生理盐水lml,此外,术前及术后第一天给予腹腔注射青霉素钠(100000U/kg),预防术后感染；3000U实验组(B组,N=8)：按脊髓挤压的方法造模后,分别在术后2小时、1、3天给予腹腔注射促红细胞生成素(3000U/kg),此外,术前及术后第一天给予腹腔注射青霉素钠(100000U/kg),预防术后感染；4000U实验组(C组,N=8)：按脊髓挤压的方法造模后,分别在术后2小时、1、3天给予腹腔注射促红细胞生成素(4000U/kg),此外,术前及术后第一天给予腹腔注射青霉素钠(100000U/kg),预防术后感染；5000U实验组(D组,N=8’)：按脊髓挤压的方法造模后,分别在术后2小时、1、3天给予腹腔注射促红细胞生成素(5000U/kg),此外,术前及术后第一天给予腹腔注射青霉素钠(100000U/kg),预防术后感染。在第二阶段实验中,按与第一阶段同样实验的方法,将24只健康雄性SD大鼠同样随机分为4组：对照组(Aa组,n=6)：按照第一阶段相同的造模方法,造模成功后,给予脊髓损伤大鼠lml生理盐水腹腔注射在术后2小时、1、3、8、15、22天,此外,术前及术后第一天给予腹腔注射青霉素钠(100000U/kg),预防术后感染；3000U(Bb组,n=6)：脊髓损伤大鼠被给予促红细胞生成素(3000U/kg)通过腹腔注射在术后2小时、1、3、8、15、22天,此外,术前及术后第一天给予腹腔注射青霉素钠(100000U/kg),预防术后感染；4000U(Bb组,n=6)：脊髓损伤大鼠被给予促红细胞生成素(4000U/kg)通过腹腔注射在术后2小时、1、3、8、15、22天,此外,术前及术后第一天给予腹腔注射青霉素钠(100000U/埏),预防术后感染；5000U(Bb组,n=6)：脊髓损伤大鼠被给予促红细胞生成素(5000U/kg)通过腹腔注射在术后2小时、1、3、8、15、22天,此外,术前及术后第一天给予腹腔注射青霉素钠(100000U/kg),预防术后感染。主要的观察及研究指标：在第一阶段的实验SD大鼠,造模后共观察4天,在术后-1(术前)、0、1、2、3、4天行BBB评分,术后第4天行BBB评分后予以过量的戊巴比妥钠腹腔注射处死,取损伤脊髓节段用于炎症指数、凋亡指数、组织病理观察及脊萌超微结构的研究；在实验第二阶段的SD大鼠,共被观察4周,在术后-1、0、2、4、7、14、21、28天行BBB评分及固蓝染色(LFB)。脊髓损伤造模方法实验动物先在动物饲养房(温度20±3℃,湿度50±20%,每日光照12h)内适应环境1周,每笼2只大鼠,自由进食、水。动物于术前12小时禁食、水,为了预防术后感染,术前30min给予青霉素钠(200000U/kg)肌肉注射。戊巴比妥钠(70mg/kg)腹腔注射麻醉后,将大鼠俯卧位固定于手术台上,用剪刀减去手术区域的毛发,然后用3%碘伏消毒手术区,在无菌条件下行背部正中切开约2cm长的切口,以T13为标志,暴露T8-T12的棘突、横突及椎板,应用外科显微器械,仔细去除T10的终板及黄韧带,显露T10水平的脊髓,用闭合力为70g的动脉瘤夹夹持脊髓1min,然后去除动脉瘤夹,生理盐水冲洗切口后逐层缝合切口,再次用3%碘伏消毒手术切口。在手术期间,用一个加热垫来维持大鼠的体温,直至大鼠术后完全苏醒。术后每只大鼠立即腹腔注射10%葡萄糖注射液2m1,0.9%的氯化钠注射液5m1,大鼠完全苏醒后,按每笼2只送回饲养室,术后每天人工辅助排尿2-3次/日。疗效评估指标BBB运动功能评分、组织病理评级、凋亡指数、炎症指数、脊髓超微结构评分及脱髓鞘面积；统计学方法SPSS 19.0((SPSS Inc., Chicago, IL, USA))统计学软件被用于分析实验数据。除了组织病理学评级结果,其他数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示,在不同的研究时间点的BBB运动功能评分用重复测量数据的两因素的ANOVA and post hoc LSD检验,胶质细胞数、神经元细胞数、脊髓超微结构评分用one-way ANOVA and post hoc LSD检验。对于非参数数据包括炎症指数、凋亡指数、组织病理评级、脱髓鞘面积百分比则用Kruskal-Wallis检验比较组间差异,如果方差分析显示：组间差异具有统计学意义,各组之间的比较则用多个独立样本之间比较的Nemenyi检验。当P0.05时,则表示差异具有统计学意义。结果在第一阶段实验中,32只SD大鼠共被观察4天,各实验组及对照组的BBB运动功能评分在术后第4天分别为：A组(0.375±0.518)；B组(2.625±0.744)；C组(3.125±0.641)；D组(4.500±0.756),且在整个4天的研究期间,最好的运动功能评分被观察到在D组,此外,各实验组运动功能的改善均好于A组(P0.01)在此期间。在第二阶段实验中,24只脊髓损伤SD大鼠共被观察4周,在术后第28天的BBB运动功能评分分别为：Aa组(7.833±1.472)；Bb组(12.333±0.816)；Cc组(12.833±0.753)；Dd组(14.500±0.548),最好的运动功能改善情况同样在Dd组被观察到,各实验组的运动功能改善情况均好于Aa组(P0.001),此外,在第一和第二阶段的实验中,3000U组和4000U组在改善急性胸脊髓损伤的大鼠运动功能方面作用相似(P0.05),尽管4000U组平均BBB运动功能评分稍微高于3000U组。组织病理学方面,5000U组获得最好的组织病理学改善,而3000U组和4000单位组在组织病理学改善方面差异无统计学意义(P0.05),但各实验组的病理改善情况好于对照组(P0.05)。各实验组的炎症指数及凋亡指数均小于对照组(P0.05),但各实验组之间无统计学差异(P0.05)。实验组的脊髓损伤超微结构评分均好于对照组(P0.001),但各实验组在改善脊髓损伤超微结构方面无统计学差异(P0.05)。就脱髓鞘面积百分比而言,实验组的脊髓损伤超微结构评分均好于对照组(P0.005),且最好的髓鞘保护作用在5000U组被观察到。结论(1)、延迟应用促红细胞生成素治疗急性大鼠胸脊髓损伤具有神经保护作用；(2)、延迟应用促红细胞生成素具有降低细胞凋亡、调节炎症反应、改善运动功能、保护脊髓超微结构及促进髓鞘修复的作用；(3)、最好的组织病理学改善、BBB运动功能评分及髓鞘保护作用在5000U组被观察到；(4)、3000U、4000U及5000U组对脊髓超微结构的改善显示了保护作用,且各实验组之间的超微结构保护作用相似；(5)、3000U、4000U及5000U组在抑制细胞凋亡及炎症反应方面具有相似的治疗效果。
【关键词】：促红细胞生成素 延迟治疗 脊髓损伤 神经保护作用 超微结构 大鼠
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 第一章 前言20-24
• 第二章 实验部分24-70
• 第一节 材料与方法24-38
• 第二节 结果38-57
• 第三节 讨论57-69
• 结论69-70
• 参考文献70-78
• 全文总结78-80
• 中英文缩略词对照表80-81
• 学习期间发表论文81-82
• 致谢82-83

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 徐建广;孔维清;付一山;;甲基强的松龙与神经节苷脂治疗大鼠急性脊髓损伤[J];中国脊柱脊髓杂志;2006年S1期

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本文编号：670764