Fscb基因敲除对雄性小鼠生殖功能的影响研究
本文关键词：Fscb基因敲除对雄性小鼠生殖功能的影响研究
更多相关文章： 基因敲除 CRISPR/Cas9 动物模型 FSCB 生殖力
【摘要】：研究背景:近年来,随着环境污染、遗传和生活习惯的改变等因素的影响下,男性不育发病率呈上升趋势[1]。精子形成过程中睾丸特异性基因的适时有序表达,并驱动精子各细胞器的协调合成和装配,精子鞭毛骨架结构和相关蛋白的有序转运整合是保证精子发挥正常功能的根本物质基础[5]。已有研究发现严重弱精症或精子完全无运动的患者存在精子纤维鞘发育不良[6]。纤维鞘钙结合蛋白(Fibrous Sheath Calcium-binding protein,FSCB)是李彦锋教授首先发现并鉴定的,在精子形成过程中特异性表达并最终定位于精子鞭毛纤维鞘的环状肋板和纵形柱状体表面上的一种新蛋白[7]。该蛋白具有睾丸/精子特异性,仅在减数分裂后的精子形成后期阶段表达。前期研究[14]证实:FSCB,CABYR等蛋白可能通过直接或间接的相互作用结合装配于纤维鞘的支架蛋白AKAPs上,形成巨分子蛋白复合物,共同发挥纤维鞘的生理功能。FSCB蛋白具有保守的PXXP基序,伸展蛋白样区域和脯氨酸富积区,同时具有钙结合能力,并且其丝氨酸/苏氨酸在体内外均可被蛋白激酶A(PKA)磷酸化。因此,推断该蛋白可能是一种参与精子鞭毛运动,与精子获能和超活化作用有关的重要蛋白[7]。在精子形成过程中,FSCB蛋白定位特征和表达的时相分析研究显示,该蛋白与纤维鞘的主要结构蛋白AKAP4的表达具有高度相似性。AKAP4丰富表达于发育阶段精子纤维鞘内,为蛋白酶和多种激酶提供支架。应用基因敲除小鼠的研究证实:Akap4 / 纯合子雄鼠产生的精子数量虽然正常,但存在纤维鞘形成缺陷,表现为稀薄的环状肋板和缩短的柱状体,同时精子丧失前向运动而表现为不育[13]。为进一步了解FSCB蛋白在精子形成和精子运动中的功能,本研究应用CRISPR/Cas9系统构建鼠Fscb基因打靶载体,敲除Fscb基因全长,建立Fscb基因敲除动物模型。应用精子质量和运动分析,体内外授精分析,Western blot,免疫组化等鉴定Fscb基因敲除小鼠的表型特征,从而深入研究了Fscb基因缺失对雄鼠生育能力的影响。第一部分:鼠Fscb基因靶向敲除载体的构建及动物模型的建立目的构建sg RNA载体,建立敲除Fscb基因的动物模型。方法根据鼠fscb基因序列,设计3对针对fscb基因的向导rna寡聚核苷酸链;将3对fscbsgrna寡核苷酸单链以逐步降温的方法退火成双链,然后分别与线性化的puc57-t7-gdna质粒进行连接,连接后转化感受态大肠杆菌,菌液提取质粒dna,通过pcr测序鉴定,获得sgrna表达质粒。sgrna的表达质粒和cas9质粒都经酶切线性化,利用t7rna聚合酶体外转录。转录好的sgrna和cas9mrna混合并调整至合适浓度,通过显微注射法将rna混合物注射到b6j鼠受精卵中,注射后立即移植进b6j假孕受体鼠,获得fscb基因敲除的初建鼠(f0)。剪取鼠尾提取dna,通过pcr鉴定,选取靶基因敲除的小鼠进行传代,进一步通过ta克隆、测序检查确定突变。结果成功构建表达puc57-t7-gdna-sgrna的载体,利用t7rna聚合酶将sgrna的表达质粒和cas9质粒在体外顺利完成转录。将有活性的cas9rna和sgrna混合物直接显微注射入b6j鼠受精卵,获得f0代39只阳性小鼠,选取3只明确删除fscb基因雄鼠与野生雌鼠交配,获得f1代2雄3雌共5只阳性小鼠,将f1代杂合子雄鼠与雌鼠交配,获得纯合子小鼠。通过鉴定,成功构建两种不同基因型的fscb基因敲除鼠系,并传代繁育。westernblot分析证实纯合子雄鼠睾丸及精子内的fscb蛋白表达消失。结论通过crispr/cas9系统成功构建表达sgrna的载体,获得靶向敲除fscb基因纯合子小鼠,并成功建立了下一步分析fscb蛋白功能的基因敲除模型鼠系。第二部分fscb基因敲除对雄性小鼠生殖功能的影响目的利用fscb基因敲除小鼠,探讨fscb基因表达缺失对雄性小鼠生殖功能的影响。方法应用免疫荧光观察fscb基因敲除后小鼠睾丸组织及精子中fscb蛋白表达情况;应用计算机辅助分析小鼠精子在体外获能前后的精子运动特征、存活率和运动参数及单个精子运动轨迹;在体外获能培养条件下检测精子的体外受精能力;将fscb基因敲除纯合子(ko)、杂合子(het)、野生型(wt)雄鼠分别与野生型c57bl/6j成年雌鼠交配,观察雌鼠怀孕率,怀孕胚胎数量,自然产仔数及子代成年雄鼠生殖腺形态学是否存在差异。结果免疫荧光观察显示纯合子小鼠睾丸组织及精子中均无fscb蛋白表达,杂合子小鼠睾丸组织及精子中fscb蛋白表达与野生型相比明显减低,与预期结果相符。野生型、杂合子和纯合子小鼠精子的存活率、各项运动参数均无显著差异,无统计学意义(p0.05),精子形态和单个精子运动轨迹等也无明显差异;体外受精实验显示:各组雄鼠精子与透明带结合的平均数、透明带完整卵细胞的授精率、与无透明带卵结合的精子平均数均无差异(P均0.05)。受精能力分析研究显示,野生型、杂合子与纯合子雄鼠所对应的交配雌鼠的受孕率,怀孕胚胎数、自然产仔数,各组间均无显著差别(P0.05),各组子代成年雄鼠生殖腺发育也无明显差异。结论精子形成相关基因Fscb在精子形成过程中特异性表达,并定位于精子尾部的纤维鞘上。Fscb基因敲除后,雄性小鼠精子的运动功能及体内外受精能力无明显变化,表明该基因所编码的蛋白的功能对于精子运动和授精能力的维持可能是非必需的或可被替代的。
【关键词】：基因敲除 CRISPR/Cas9 动物模型 FSCB 生殖力
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R698.2
【目录】：
- 缩略语表4-6
- Abstract6-10
- 摘要10-13
- 第一章 前言13-17
- 第二章 鼠Fscb基因靶向敲除载体的构建及动物模型的建立17-31
- 2.1 材料与方法17-24
- 2.2 结果24-29
- 2.3 讨论29-31
- 第三章 Fscb基因敲除对雄鼠生殖功能的影响研究31-48
- 3.1 材料与方法31-36
- 3.2 结果36-44
- 3.3 讨论44-48
- 全文总结48-49
- 参考文献49-54
- 文献综述 精子形成相关基因及蛋白功能研究进展54-67
- 参考文献61-67
- 攻读硕士学位期间发表的论文67-68
- 致谢68
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