肾移植受者HCMV感染与BAFF信号活化的相关性研究

发布时间：2017-10-13 16:23

  本文关键词：肾移植受者HCMV感染与BAFF信号活化的相关性研究

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【摘要】：第一部分目的:研究肾移植受者人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染与B细胞活化因子(B cell activating factor belong to the TNF family,BAFF)信号的相关性。方法:①以来院随访的肾移植受者为研究对象,共采集113例患者抗凝外周血(EDTA-Na2抗凝)和尿液样本。采用real-time PCR法检测尿液中HCMV DNA水平。②应用real-time PCR法检测外周血单个核细胞中BAFF、BAFF-R、TLR9、NLRC5、TACI等HCMV-TLR信号和BAFF信号通路中相关因子的转录本水平;PCR芯片技术对TLR信号通路、NF-κB信号通路,以及细胞因子-细胞因子受体通路中共88个基因进行研究,以筛选肾移植受者HCMV DNA阳性组和阴性组的差异表达基因。健康志愿者为对照。③ELISA法检测血清s BAFF和总Ig G水平;间接荧光免疫试验(IFA)检测血清中抗HCMV pp65 Ig G、Ig M抗体水平,流式荧光法(Luminex)检测血清抗人类白细胞抗原HLA抗体和抗MICA抗体水平(抗HLA-ⅠⅡMICA抗体)。④采用SPSS17.0统计软件包进行分析。两个独立样本均数间的比较采用双侧t检验;相关性分析采用Spearman法及Pearson法;P0.05被认为具有统计学意义。结果:①113例来院随访肾移植病人中,尿HCMV DNA10,000拷贝/ml为12例,归为阳性组;HCMV DNA10,000拷贝/ml的为83例,以及未出现扩增的18例,归为阴性组。②ELISA结果显示,阳性组患者血清s BAFF、总Ig G水平显著高于阴性组(928±360 pg/ml vs 511±298 pg/ml,P0.05;26,260±15,960μg/ml vs 9,944±7,365μg/ml,P0.05);IFA结果显示,阳性组患者血清抗HCMV pp65 Ig G水平显著高于阴性组(P0.05);阳性组中尿HCMV DNA拷贝数与s BAFF呈正相关(r=0.988,P0.05),s BAFF与血清中总Ig G呈正相关(r=0.625,P0.05)。③Luminex检测结果显示,阳性组中抗HLA-ⅠⅡMICA抗体的阳性率为46.2%,阴性组为12.5%,差异无统计学意义。④real-time PCR发现,与尿HCMV DNA阴性组比较,阳性组中文摘要肾移植受者HCMV感染与BAFF信号活化的相关性研究BAFF m RNA水平显著增高(P0.05),其余分子(BAFF-R、TLR-9、NLRC5、TACI等)的表达未出现显著差异;基因芯片检测结果发现,表达差异基因共有46个,其中阳性组与阴性组相比较表达上调的基因有2个(BAFF-R、ICAM1),表达下调的基因22个(TLR-9、NLRC5、LIGHT等);阳性组与健康对照组相比较,表达上调的基因有2个(IFN-γ、ICAM1),表达下调的基因8个(CCL3L1、IL12B、ILIR1等);阴性组与健康对照组相比较表达上调的基因有11个(IFN-γ、IRAK4、NF-κB2等),表达下调的基因1个(BAFF-R)。结论:肾移植受者HCMV感染后,HCMV-TLR信号活化可能引发或促进BAFF信号活化;HCMV-TLR信号与BAFF信号独立或协作参与移植肾损伤。第二部分目的:体外探索HCMV-TLR9信号与BAFF信号串话的可能机制和效应。方法:①HCMV感染HFL-1细胞,以无HCMV感染的HFL-1细胞作对照。在感染第1,3,5,7天时收获细胞,提取全蛋白。Western Blot法分析NLRC5、TLR9、TRAF6、IRAK4等蛋白在各不同时相的表达水平变化。②HCMV直接感染人扁桃体B淋巴细胞,或以HCMV感染后的HFL-1细胞与扁桃体B淋巴细胞共培养。在共培养第1,3,5,7天后收获细胞和培养上清。流式分析各个时相B细胞的凋亡率及CD19+、BAFF+、BAFF-R+、TACI+、BCMA+的表达强度;ELISA检测不同实验分组细胞培养上清的Ig G分泌水平。另外,用5μg/ml Cp G ODN2006及其阴性对照,2.5μg/ml Cp G ODN4084-F和50μg/ml Poly(I:C),及200 ng/ml重组BAFF蛋白体外作用于B细胞作为对照。③采用中和性抗BAFF-R抗体在HCMV或Cp G ODN2006感染B细胞之前或之后阻抑BAFF信号,继续培养5天,收集相应的细胞和细胞培养上清,分别用流式和ELISA检测B细胞凋亡率和分泌Ig G水平,以分析HCMV感染、BAFF信号串话对B细胞生长及功能的影响;以HCMV、Cp G ODN2006、抗BAFF-R抗体单独作用作为对照,以不加任何刺激剂作为空白对照。体外实验用来分析HCMV感染对B细胞生物学功能的影响。④采用SPSS17.0统计软件包进行分析。两个独立样本均数间的比较采用双侧t检验;多组实验间采用ANOVA方法进行两两比较;P0.05被认为具有统计学意义。结果:①Western Blot结果显示HCMV感染HFL-1细胞后,TLR9的表达水平随感染时间先升高后下降,TRAF6和IRAK4则随时间呈下降趋势(时相间差异具有统计学意义),NLRC5水平则未出现明显变化;对照组中各蛋白表达水平随时间均未出现明显变化。②与HCMV感染的HFL-1细胞共培养的B细胞凋亡率在培养的第1-3天和第5-7天间出现显著的上升,但在第0-1天、第3-5天之间则出现平台期;与正常HFL-1细胞共培养的B细胞凋亡率呈现持续上升趋势。HCMV直接刺激B细胞,B细胞的早期凋亡率在第1-5天未出现明显上升;Cp G ODN2006直接刺激B细胞,B细胞的早期凋亡率在第0-1天下调,第1-5天缓慢上调;Cp G ODN2006 Control和rh BAFF直接刺激B细胞,B细胞的早期凋亡率与不加任何制剂刺激相比无显著差异;Cp G ODN4084-F、Poly(I:C)刺激的B细胞的凋亡率持续上升,且在相应的时间点高于对照组;对照组中未用任何制剂刺激的B细胞早期凋亡率持续上升。③HCMV直接或间接感染B细胞,B细胞表面BAFF-R持续高水平表达;受rh BAFF和Cp G ODN2006刺激的B细胞BAFF-R表达水平与HCMV感染类似。Cp G ODN2006Control、Cp G ODN4084-F、Poly(I:C)刺激组和对照组中B细胞BAFF-R表达水平未出现明显规律。B细胞表面BAFF及其受体TACI、BCMA的表达水平在各实验组中均未发现明显变化趋势。④HCMV刺激B细胞之前阻抑BAFF信号,B细胞凋亡率上升,但Ig G分泌水平无显著变化;Cp G ODN2006刺激B细胞之前阻抑BAFF信号,B细胞凋亡率显著上升,Ig G分泌水平显著下降;HCMV、Cp G ODN2006、抗BAFF-R抗体单独刺激B细胞对其早期凋亡率无显著影响,HCMV、Cp G ODN2006单独刺激B细胞后B细胞Ig G分泌水平上调。结论:HCMV感染可在一定时间范围内增强HCMV-TLR9信号;HCMV-TLR9信号与BAFF信号串话,并在一定程度上抑制B细胞凋亡。
【关键词】：
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R699.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 引言11-14
• 第一部分 肾移植受者HCMV感染与BAFF信号活化的相关性分析14-29
• 1 材料与方法14-21
• 2 结果21-26
• 3 讨论26-29
• 第二部分HCMV体外感染人胚肺成纤维细胞及其对人B淋巴细胞的作用机制研究29-46
• 1 材料与方法29-33
• 2 结果33-43
• 3 讨论43-46
• 参考文献46-52
• 综述52-60
• 参考文献55-60
• 中英文缩略词表60-62
• 攻读研究生期间发表论文62-63
• 致谢63-65

【参考文献】

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1 周亮;陆兵勋;尹恝;;细胞色素CYP2D6基因多态性与海洛因海绵状白质脑病易感性的关系[J];南方医科大学学报;2010年03期

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本文编号：1025894