C3a分泌性表达载体及过表达C3a肾小管上皮细胞株的构建

发布时间：2017-10-14 00:36

本文关键词：C3a分泌性表达载体及过表达C3a肾小管上皮细胞株的构建

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【摘要】：目的已有的研究表明包括糖尿病肾病在内的多种肾病患者肾小管上皮细胞存在C3a/C3aR轴过度活化现象,但有关C3a/C3aR轴过度活化在肾小管上皮细胞中的病理意义未知。文中构建分泌性过表达C3a的肾小肾小管上皮细胞株,为探讨各种病理情况下C3a/C3aR轴过度活化的病理意义提供细胞模型。方法设计合成人C3a分泌性表达单元,将其克隆到慢病毒表达载体p Lenti6.3-MCS-IRES2-EGFP的多克隆位点,构建成C3a分泌性表达载体p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;将p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP和包装质粒共转染293 T细胞,包装成C3a表达重组慢病毒LV-C3a;以LV-C3a感染人肾小管上皮细胞系HK2,根据LV-C3a上带有杀稻瘟菌素抗性基因的特点,以杀稻瘟菌素筛选稳定转染细胞克隆;利用荧光定量PCR和ELISA方法对稳定转染细胞克隆的C3a表达水平和分泌情况进行分析,从中鉴定出稳定分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株。结果 1成功构建了序列完全正确的C3a分泌性表达载体p Lenti6.3-C3a-IRES2-EGFP;2成功进行了重组慢病毒包装,得到了高滴度(5×108个/m L)的C3a表达重组慢病毒LV-C3a;3成功进行了LV-C3a对HK2细胞的转染,得到了稳定转染LV-C3a的HK2细胞株;基于荧光定量PCR和ELISA的分析证实,与HK2细胞比较,HK2-C3a细胞株中C3a mRNA表达水平显著升高[(1.0±0.5)vs(1 321.0±18.0),P0.01],分泌的C3a水平显著升高[(0.3±0.2)ng/m L vs(249.0±37.0)ng/m L,P0.01]。结论成功构建的C3a分泌性慢病毒表达载体和分泌性过表达C3a的人肾小管上皮细胞株为进一步研究各种病理情景中C3a/C3aR过度活化在人肾小管上皮细胞中的病理意义提供了很好的细胞模型,也为进一步开展C3a/C3aR过度活化在其他细胞中的病理意义创造了条件。
【作者单位】：南京军区南京总医院国家肾脏疾病临床医学研究中心全军肾脏病研究所;南京军区南京总医院比较医学科;
【关键词】： Ca CaR 慢病毒 肾小管上皮细胞 过表达
【基金】：国家自然科学基金(81370828)
【分类号】：R692
【正文快照】： 0引言补体系统的不适当激活也会导致组织的损伤。越来越多的研究表明,补体系统参与了多种人类疾病的发生、发展过程[1-4]。补体活化与包括糖尿病肾病在内的多种病变相关[5-7]。但有关补体系统参与糖尿病肾病等肾组织损伤的机制仍未明了。膜攻击复合物的形成是各种补体活化通路

【参考文献】

中国期刊全文数据库前2条

1 郑敬民;尹广;姚根宏;王建平;刘志红;;肾病患者肾组织补体活化与肥大细胞浸润的关系研究[J];医学研究生学报;2012年10期

2 胡金川;田亚平;江朝光;温新宇;高艳红;董矜;郭广宏;王玲;董振南;;红细胞补体受体1分子水平及其基因单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的关联研究[J];医学研究生学报;2013年07期

【共引文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 郑敬民;尹广;姚根宏;王建平;刘志红;;肾组织肥大细胞表型特点分析研究[J];东南国防医药;2013年02期

2 叶芬;程莹莹;吴艳;黄振平;;狼疮性肾炎患者白内障超声乳化术后角膜内皮细胞的观察[J];国际眼科杂志;2014年09期

3 宁昌;陈文伟;黎燕;陈国江;;补体系统与肿瘤的关系研究进展[J];国际药学研究杂志;2014年05期

4 周新人;王方;;补体异常与肝硬化关系研究进展[J];实用肝脏病杂志;2014年06期

5 郑敬民;尹广;赵文紧;刘志红;;过表达C3aR人足细胞的构建及鉴定[J];东南国防医药;2014年06期

6 甄珠;刘克芹;;可溶性黏附分子水平与系统性红斑狼疮中医辨证分型的关系[J];长春中医药大学学报;2015年02期