膀胱癌中唾液酸酶Neu1的异常表达对Toll样受体的影响研究

发布时间：2017-11-01 08:43

  本文关键词：膀胱癌中唾液酸酶Neu1的异常表达对Toll样受体的影响研究

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【摘要】：哺乳动物细胞内的大部分蛋白或脂类均可能被糖基化修饰,而其糖链末端往往会被唾液酸化。唾液酸(Sialic acids,Sias)是一类九碳糖,报道显示多种肿瘤细胞表面糖蛋白质和糖脂中唾液酸表达出现异常,一般认为,肿瘤的侵袭和转移与其细胞表面的唾液酸的表达量呈正相关,因此许多研究认为可以将唾液酸作为潜在的肿瘤标志物。与唾液酸代谢有关的酶分为两类,一类是催化唾液酸修饰的唾液酸转移酶(Sialyltransferase,ST),一类是去除唾液酸修饰的唾液酸酶(Sialidase,SA或称为Neuraminidase,Neu)。哺乳动物体内共发现四种唾液酸酶Neu1,Neu2,Neu3,Neu4,最近研究发现唾液酸酶Neu1在多种肿瘤细胞中发挥着重要作用。因此,唾液酸酶Neu1作为水解释放糖链中唾液酸残基的酶,其相关研究能够对肿瘤的诊断和治疗提供一定的理论基础。为研究Neu1在肿瘤的发生发展中的角色,本研究以膀胱正常上皮细胞HCV29、非侵染性膀胱癌细胞KK47和侵染性的膀胱癌细胞J82、YTS-1和T24作为研究模型。首先用凝集素染色和特异荧光底物检测比较这5株细胞中的唾液酸的表达和唾液酸酶的活性,并进一步采用荧光定量PCR方法检测相关的唾液酸酶和唾液酸转移酶的基因表达,发现唾液酸酶Neu1在正常细胞中表达量最高,在非侵染性肿瘤细胞中次之,在侵染性肿瘤细胞中表达量最低。随后采用半定量及定量PCR从m RNA水平,用Western blotting与细胞免疫荧光从蛋白水平验证了Neu1的表达均与上述结果相符。另外,膀胱癌组织芯片的结果也同样证实癌症组织中Neu1含量表达量低于正常组织。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程被认为与肿瘤的发展、转移等相关,而转化生长因子(Transforming growth factor,TGF-β)可以诱导这一过程。本实验在Neu1表达量相对较高的三株细胞(HCV29,KK47,J82)中添加TGF-β诱发EMT,发现伴随EMT的发生,Neu1表达量显著下调。继而通过在膀胱癌细胞YTS-1和T24细胞中转染Neu1,筛选到稳定高表达Neu1的细胞株,发现该细胞株细胞增殖能力和细胞与胞外基质间的粘附能力下降,而凋亡增强。此外同样检测了未做处理及TGF-β处理前后细胞中Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)的表达情况,发现其中TLR3变化趋势与Neu1一致,而过表达Neu1后,TLR3表达提高,其下游的NF-κB信号通路被激活。综上所述,本文评估了Neu1的表达与膀胱癌肿瘤发展的相关性,Neu1的高表达可以降低膀胱癌细胞的增殖等能力以及对TLR3的表达及相关下游信号通路调控的影响,以期为膀胱癌的临床诊疗开拓新思路并提供理论依据。
【关键词】：唾液酸 Neu1 膀胱癌 Toll样受体 信号通路
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 绪论8-16
• 1.1 糖生物学概述8-9
• 1.2 肿瘤细胞中糖链的异常唾液酸化修饰9-11
• 1.2.1 唾液酸9
• 1.2.2 异常唾液酸化与恶性肿瘤9
• 1.2.3 唾液酸转移酶9-10
• 1.2.4 唾液酸酶10-11
• 1.3 Toll样受体的信号转导11-13
• 1.3.1 Toll样受体概述11-12
• 1.3.2 TLRs介导的信号传导途径12
• 1.3.3 NF-κB途径12-13
• 1.4 常用的肿瘤细胞模型-上皮间质转化模型13-14
• 1.5 立题依据及意义14
• 1.6 主要研究内容14-16
• 第二章 材料与方法16-24
• 2.1 实验材料16-18
• 2.1.1 菌株、细胞株与质粒16
• 2.1.2 培养基16
• 2.1.3 主要试剂16-18
• 2.1.4 主要仪器18
• 2.2 实验方法18-24
• 2.2.1 引物设计和目的基因的扩增18-20
• 2.2.2 NEU1基因真核表达载体的构建20
• 2.2.3 细胞培养20
• 2.2.4 细胞稳定转染及阳性单克隆的筛选20-21
• 2.2.5 瞬时干扰21
• 2.2.6 实时荧光定量PCR21
• 2.2.7 蛋白免疫印迹法（Western blotting）21-22
• 2.2.8 MTT法检测细胞增殖22
• 2.2.9 细胞与基质间的粘附实验22
• 2.2.10 唾液酸酶活测定22
• 2.2.11 凝集素染色22-23
• 2.2.12 细胞免疫荧光23
• 2.2.13 细胞划痕实验23
• 2.2.14 流式细胞检测23
• 2.2.15 免疫组化IHC23
• 2.2.16 数据的统计学分析处理23-24
• 第三章 结果与讨论24-42
• 3.1 唾液酸酶Neu1与膀胱癌发展的相关性研究24-30
• 3.1.1 膀胱癌细胞中含唾液酸糖链及唾液酸酶酶活的测定24-25
• 3.1.2 唾液酸酶及唾液酸转移酶在不同转移潜能膀胱癌细胞中的表达25
• 3.1.3 唾液酸酶Neu1在不同膀胱癌细胞中的表达25-26
• 3.1.4 Neu1与膀胱癌患者病理的相关性研究26-30
• 3.1.5 小结30
• 3.2 上皮间质转化（EMT）过程对Neu1表达影响30-34
• 3.2.1 TGF-β 诱导的EMT细胞模型构建30-31
• 3.2.2 EMT发生后促进细胞迁移31-32
• 3.2.3 EMT细胞模型中Sias表达水平研究32-33
• 3.2.4 EMT发生后细胞中Neu1的表达减少33-34
• 3.2.5 小结34
• 3.3 Neu1对膀胱癌细胞行为的影响及其作用机制研究34-42
• 3.3.1 过表达Neu1稳转细胞株的阳性筛选34-35
• 3.3.2 过表达Neu1对细胞生物学行为的影响35-38
• 3.3.3 Toll样受体（TLRs）在膀胱癌细胞系中的表达38
• 3.3.4 Neu1与Toll样受体 3（TLR3）的表达关联38-40
• 3.3.5 Neu1与TLR3的下游通路（NF-κB途径）之间的关系40-41
• 3.3.6 小结41-42
• 主要结论与展望42-44
• 主要结论42
• 展望42-44
• 致谢44-45
• 参考文献45-50
• 附录： 作者在攻读硕士学位期间发表的论文50

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本文编号：1126092