晚期氧化蛋白产物诱导人肾小球内皮细胞发生间充质转分化的机制研究

发布时间：2017-11-05 19:08

  本文关键词：晚期氧化蛋白产物诱导人肾小球内皮细胞发生间充质转分化的机制研究

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【摘要】：[研究背景]糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是全球范围内引起终末期肾病的首要原因。蛋白尿是DN的主要临床特征,也是促进DN进展的独立危险因素,可由肾小球滤过屏障损害所致。肾小球内皮细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,在调节肾小球滤过率中发挥着重要的作用。肾小球内皮细胞损伤可导致肾小球滤过功能的功能失调,进而导致蛋白尿的发生。此外,近年来,越来越多研究提示肾小球内皮细胞功能失调可促DN的进展。值得注意的是,内皮细胞间充质转分化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT/EndoMT),本质上可视为上皮细胞间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的一种特殊类型,在内皮细胞损伤过程及肾小球硬化和肾小管间质纤维化的发生发展中起着重要的作用,而肾脏纤维化是DN的主要病理特征。EndMT发生时,内皮细胞失去其特异性标志物,如血小板内皮细胞粘附分子-1/CD31(plateletendothelial cell adhesion molecule/cluster of differentiation 31 PECAM-1/CD31)、血管内皮细胞钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)、 claudin5等,而重新获得间充质细胞特异性标志物,如成纤维细胞特异性蛋白-1(fibroblast specific protein-1, FSP-1)、波形蛋白(vimentin)、和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)等。 EndMT这个概念最先出现在胚胎心脏发育中,但近年来越来越多的研究显示EndMT在多种肾脏疾病中的肾纤维化过程中起着重要的作用。Zeisberg等学者利用三种不同的小鼠肾病模型(包括链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病模型),最先报道肾脏纤维化中肌成纤维细胞细胞可能来源于EndMT,而肌成纤维细胞在肾脏纤维化中发挥重要作用。随后,Li等学者研究证明了EndMT可促进早期DN的肾脏纤维化的发生及发展过程。综上,EndMT可促进DN肾脏纤维化的进展。因此,探讨诱导EndMT发生的机制可能为DN的防治提供新的干预靶点。然而,目前关于EndMT发生的机制仍知之甚少。多种因素可导致内皮细胞损伤。最近研究提示,晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products, AOPPs)可通过激活晚期糖基化终产物受体(receptor of advanced glycation end products, RAGE)介导的信号通路激活血管内皮细胞。AOPPs是由Witko-Sarsat等学者于1996年首次在慢性肾衰患者血浆中发现的一类尿毒症毒素,其主要成分是血清白蛋白酪氨酸残基氧化后形成的蛋白交联产物。近年来,越来越多的研究证据表明AOPPs参与了多种肾脏疾病(包括DN)的发生发展的过程。我们课题组最近的研究也证明了AOPPs可诱导人近端肾小管上皮细胞肥大及发生EMT。但是,AOPPs是否可诱导EndMT的发生及其机制目前尚待阐明。内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress, ERS)在肾脏病理生理过程中发挥着重要作用。内质网应激是由多种因素(如：饥饿、缺氧、病毒感染等)引起的病理生理状态。内质网腔中未折叠或错误折叠的蛋白可导致内质网应激,进而引起未折叠蛋白反应(一种内质网的适应性过程)。然而,由过强或持久的内质网应激引起的未折叠蛋白反应也可诱发细胞凋亡途径。内质网应激可诱导肺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、及肾小管上皮细胞发生EMT。值得注意的是,研究表明内质网应激可导致肾小球内皮细胞损伤。但是,内质网应激在AOPPs诱导的肾小球内皮细胞损伤过程中的作用尚未明确。[目的]本研究以体外培养的人肾小球内皮细胞(human renal glomerular endothelial cells, HRGECs)为研究对象,首先,探讨AOPPs是否可诱导人肾小球内皮细胞EndMT的发生,然后,探讨AOPPs是否可诱导人肾小球内皮细胞内质网应激的发生,最后,探讨内质网应激是否介导了AOPPs诱导人肾小球内皮细胞EndMT的过程。[研究方法]1.无内毒素AOPPs修饰蛋白的制备和鉴定参考文献方法体外制备AOPPs-BSAo将经纯化后、无内毒素的100 mg/mLBSA与200 mmol/L次氧酸等体积混合后(不含碳水化合物、游离脂肪酸和脂质,以排除形成AGEs样结构),于室温放置30分钟后,即可制备出BSA与次氯酸摩尔比为1：140的AOPPs-BSA.,制备的AOPPs-BSA在无菌PBS中透析24小时以去除游离的次氯酸。将100 mg/mL BSA与PBS等体积混合,作为对照。制备的AOPPs和BSA对照均需要经过Detoxi-Gel凝胶柱去除内毒素。所有制备的AOPPs-BSA和未经过修饰的BSA经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.025EU/ml。 AOPPs含量通过测定酸性条件下340 nm的光吸收,以氯胺T为标准取得。通过上述方法所制备的AOPPs-BSA和未经修饰的BSA的AOPPs含量分别为65.2 ± 2.12 nmol/mg蛋白和0.2 ± 0.04 nmol/mg蛋白。2.人肾小球内皮细胞的培养人肾小球内皮细胞HRGECs细胞购自美国ScienCell Research Laboratories 。细胞复苏后在37℃、5%CO2条件下,用含5%的胎牛血清、1%的内皮细胞生长添加剂(ECGS)及100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的内皮细胞培养基培养细胞。待细胞生长至约80%融合时用于进行试验。本研究用2-5代细胞进行实验。人肾小球内皮细胞在无血清培养基静置细胞24小时后用于实验。3. AOPPs诱导人肾小球内皮细胞发生EndMT人肾小球内皮细胞分别与AOPPs (50、100、200、及400 μg/mL)或未经修饰的BSA (200 μg/mL)共同孵育24小时,或人肾小球内皮细胞分别与200μg/mLAOPPs或200 μg/mL未经修饰的BSA共同孵育12、24、48小时,实时荧光定量PCR法检测内皮细胞标志性物CD31、 VE-cadherin、 claudin5和间充质细胞标志性物FSP-1、 α-SMA、及vimentin的mRNA表达水平4. AOPPs激活人肾小球内皮细胞内质网应激人肾小球内皮细胞分别与AOPPs (50、100、200、及400 μg/mL)或未经修饰的BSA (200 μg/mL)共同孵育24小时,或人肾小球内皮细胞分别与200μg/mLAOPPs或200 μg/mL未经修饰的BSA共同孵育12、24、48小时,实时荧光定量PCR法检测内质网应激标志性蛋白GRP78和CHOP的mRNA表达水平5.内质网应激介导AOPPs诱导人肾小球内皮细胞发生EndMT的过程人肾小球内皮细胞分别与200 μg/mL未经修饰的BSA或者200 μg/mL AOPPs共同孵育24小时,或者在内质网应激阻断剂salubrinal的预刺激下与200μg/mL AOPPs共同孵育24小时,或者与内质网应激诱导剂thapsigargin共同孵育24小时。分别使用实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测GRP78、 CHOP、 CD31、 VE-cadherin、claudin5、FSP-1、α-SMA、及vimentin的mRNA和蛋白表达水平6.统计学分析所有实验都重复三次。各组计量资料用均数±标准差(x+SD)表示。多组均数因素之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。若方差齐时,组间多重比较采用LSD法；若方差不齐,组间多重比较则采用Dunnett's T3法。P0.05认为差异具有统计学意义。实验数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析。[结果]1. AOPPs诱导人肾小球内皮细胞发生EndMT为了探讨AOPPs是否可诱导人肾小球内皮细胞发生EndMT,我们将人肾小球内皮细胞与AOPPs或未被修饰的BSA共同孵育后检测内皮细胞标志性蛋白CD31、VE-cadherin、claudin5的表达变化及检测间充质细胞特异性标志性蛋白FSP-1、α-SMA、及vimentin的表达变化。实验结果显示,与空白对照组相比,AOPPs以浓度和时间依赖方式下调内皮细胞标志性蛋白(CD31、VE-cadherin.及claudin5)的mRNA表达水平,但以浓度和时间方式上调间充质细胞标志性蛋白(FSP-1、 α-SMA、及vimentin)的mRNA表达水平。然而,未经修饰的BSA对人肾小球内皮细胞的内皮标志性蛋白及间充质细胞标志性蛋白的表达水平无明显影响,提示这些变化与BSA的氧化修饰有关。以上实验结果提示AOPPs可诱导人肾小球内皮细胞EndMT的发生。2. AOPPs激活人肾小球内皮细胞的内质网应激反应为了探讨AOPPs是否会诱导人肾小球内皮细胞发生内质网应激,我们使用实时荧光定量PCR法检测内质网应激发生的标志性蛋白GRP78和CHOP的表达。实验结果显示,与空白对照组相比,AOPPs组以浓度和时间依赖方式上调GRP78和CHOP的mRNA表达水平。但是未经修饰的BSA对人肾小球内皮细胞GRP78和CHOP的表达水平无明显影响,提示这些变化与BSA的氧化修饰有关。以上实验结果提示AOPPs可诱导人肾小球内皮细胞内质网应激的发生。3. AOPPs通过激活内质网应激诱导人肾小球内皮细胞发生EndMT本研究中,为了进一步探讨内质网应激在AOPPs诱导人肾小管上皮细胞发生EndMT过程中的作用,我们将细胞分为四组,分别为：白蛋白组、AOPPs处理组、毒胡萝卜素处理组(thapsigargin, Tg组)、AOPPs+salubrinal组。其中毒胡萝卜素是内质网应激的诱导剂,salubrinal是内质网应激的阻断剂。实验结果显示,与AOPPs组相比,AOPPs+salubrinal组内皮细胞标志性蛋白(VE-cadherin、CD31、及claudin5)的mRNA和蛋白表达水平上调,而间质细胞标志性蛋白(α-SMA、vimentin、及FSP-1)的mRNA和蛋白表达下调。此外,与AOPPs组相比,AOPPs+salubrinal组内质网应激标志性蛋白GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表达水平均增高。上述结果提示内质网应激阻断剂salubrinal能抑制AOPPs诱导的肾小球内皮细胞的发生。但是,与空白对照组相比,内质网应激诱导剂thapsigargin能使内皮标志性蛋白(VE-cadherin、CD31、及claudin5)的mRNA和蛋白表达水平下调,使间质标志性蛋白(α-SMA、vimentin、及FSP-1)的mRNA和蛋白表达水平上调。此外,与空白对照组相比,thapsigargin还使内质网应激的标志性蛋白GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表达水平均上调。上述结果提示内质网应激诱导剂thapsigargin能诱导人肾小球内皮细胞发生EndMT。综合上述结果,内质网应激介导了AOPPs诱导人肾小球内皮细胞发生EndMT的过程。[结论]本研究证明了AOPPs可诱导人肾小球内皮细胞发生EndMT,还证明了AOPPs可激活人肾小球内皮细胞内质网应激。然而,未修饰的BSA并不能产生AOPPs导致的上述作用,提示这些作用是由于氧化修饰蛋白产生,而非BSA本身或者其他物质所致。更加重要的是,本研究首次证明了内质网应激介导AOPPs诱导人肾小球内皮细胞发生EndMT的过程。本研究进一步阐明了AOPPs促进DN进展的机制,为寻找防治DN新的干预靶点提供理论依据。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692.9;R587.2

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本文编号：1145466