肾小管上皮细胞C3aR的表达调控及其活化作用研究

发布时间：2017-11-07 06:10

  本文关键词：肾小管上皮细胞C3aR的表达调控及其活化作用研究

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【摘要】：研究背景补体系统是一种生物级联反应体系,具有复杂而精密的调控机制,包含30多种血浆和细胞相关蛋白。补体系统组成成分大致可分为能与细胞结合的固有成分、各种调节因子以及相关的补体受体等。补体系统能被众多因素激活发生级联酶促反应,这些因素包括病原体、自身抗体、细胞凋亡以及组织的缺血缺氧和坏死等。补体系统的激活主要通过三种途径,即经典途径、旁路途径和甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)途径。三种活化途径生成的C3转化酶促使补体C3活化、裂解,释放C3b调理素、生成C5转化酶,最后形成C5b-9,也称作膜攻击复合物(membrane attack complex, MAC)。C5b-9能够破坏靶细胞的磷脂双分子层,导致细胞损伤以及凋亡,它还能够活化中性粒细胞、内皮细胞及上皮细胞,参与炎性反应。补体系统也是先天免疫的一个重要组成部分,它们可以识别来源于普通病原体的保守抗原,并做出迅速而强烈的回应。而除参与机体的宿主防御外,补体系统正常或异常激活还参与包括肾脏病在内多种疾病的发生及进展。以往人们对肾脏疾病中的补体系统功能的关注更多的是MAC效应,然而近年来,在补体活化过程中,由补体C3通过C3转化酶催化而裂解生成的小片段C3a以及其特异性受体C3aR在肾脏疾病病理过程中的作用逐渐受到学者们的广泛关注。补体系统经过三种途径激活后共同生成C3转化酶,并催化裂解补体C3,使其生成大片段C3b和其代谢物(iC3b,C3dg)以及小片段(C3a), C3b再经过一系列级联酶促反应,最终生成C5b-9。C3a是一个大约包含77个氨基酸残基的多肽,作为一种强效的促炎因子,除了能够参与机体的先天性免疫反应,C3a还能作用于广泛的免疫及非免疫性细胞发挥众多的生物学效应。例如,调节血管舒张,增加小血管的通透性,引发平滑肌的收缩。对于有吞噬功能的细胞(中性粒细胞、巨噬细胞),C3a有强烈的化学趋化作用,使吞噬细胞迁移至组织的损伤或炎症区域。C3a还能促进嗜碱性粒细胞和肥大细胞释放组胺,引发中性粒细胞的氧化猝发现象。C3a还参与组织的再生和纤维化过程,如促进肝脏组织的再生。C3aR是C3a的特异性受体,它属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCR)超级家族的一员,拥有一个通过胞内胞外环结构链接的7次跨膜结构域。在过去的十年中,已有许多文献报道C3aR表达于众多类型细胞上。众所周知,对于骨髓源性细胞,如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞及肥大细胞等均能检测到C3aR的表达,当然,C3aR也会表达于如活化的星形胶质细胞、内皮细胞、上皮细胞以及平滑肌细胞这类非骨髓源性细胞上。而近几年的研究表明,在肾脏组织中,其小管上皮细胞和足细胞也均能表达C3aR,且多种肾脏疾病模式小鼠的肾组织中,C3aR mRNA及蛋白表达明显上调,这种表达上调在肾脏疾病发病前就己出现,说明C3a/C3aR轴异常激活参与肾脏疾病的发生发展,而不是单纯由疾病导致的伴随现象。肾脏疾病的发病机制与补体系统激活的关系错综复杂,许多研究发现,肾脏疾病如：各类自身抗体介导的肾小球肾炎,C3肾小球沉积病,移植肾后缺血再灌注损伤以及抗体介导的排斥反应均有补体级联反应的参与,且各个补体成分或调控因子所发挥的作用并不相同。作为补体系统中的一个组成部分,C3a/C3aR轴在肾脏疾病中的作用逐渐受到众多学者们的重视,而一些相关文献也表明C3a/C3aR轴正常或异常活化在肾脏疾病中起着更为直接和显著的作用,也预示着C3a/C3aR轴可能是治疗相关肾脏疾病的一个新治疗靶点。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是一种进展性的肾脏纤维化疾病,是糖尿病常见的并发症,也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。在以往的工作当中,我们观察到,DN患者以及糖尿病小鼠的肾组织中C3aR表达均显著上调,我们推测C3a/C3aR轴活化在DN中也发挥了重要作用,但是具体机制不清,为了更好地了解肾脏组织中C3aR表达调控因素,我们研究了多种炎性细胞因子(IFN-γ、C3a、IL-1β、TNF-α、TGF-β1)对人肾小管上皮细胞(HK2细胞)C3a受体表达调控。另外,肾小管间质纤维化、肾小球硬化是DN肾脏损害的重要表现,一些研究显示,上皮-间质细胞转分化(EMT)在肾脏纤维化中发挥重要作用,我们猜测C3a/C3aR轴的活化可能引发小管上皮细胞发生上皮-间质转分化进而加速肾脏纤维化的进展,因此,我们构建了鼠原代肾小管上皮细胞培养及鉴定的方法,并探究C3aR活化是否能够引起鼠小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化。第一部分炎症细胞因子对人肾小管上皮细胞C3a受体的表达调控目的在以往的工作中,我们发现在糖尿病肾病患者的肾组织中C3aR表达增加,但其具体机制不清,因此,为了更好了解肾脏组织中C3aR表达调控因素,我们研究了多种炎性细胞因子对人肾小管上皮细胞(HK2细胞)C3a受体表达的调控作用。方法HK2细胞以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。将HK2细胞以1×105/孔的密度接种于12孔板中,放入37℃、含5%C02细胞孵育箱进行培养,待孔内细胞密度长至80%融合时换成含0.1%胎牛血清的DMEM/F12培养基同步化12-18h。用多种炎症因子(IFN-γ、C3a、IL-1β、TNF-α、TGF-β)与已同步化的HK2细胞共培育,根据相关文献,每种炎症因子刺激分为浓度梯度及时间梯度组,利用Real-time PCR检测HK2细胞C3aR mRNA的表达水平。选择对HK2细胞C3aR mRNA表达具有显著促进作用的炎性因子IFN-γ作为刺激剂刺激HK2细胞,通过免疫组织化学及免疫印迹的方法探测HK2细胞C3aR蛋白的表达水平。结果我们发现炎症细胞因子IFN-γ能够显著的促进HK2细胞C3aR的表达上调(与正常对照组相比,C3aR mRNA表达水平增长大约5倍,P=0.001,蛋白水平表达上调大约1.6倍,P=0.046),且HK2细胞C3aR mRNA水平表达上调与IFN-γ成剂量及时间依赖关系；而其他的炎性细胞因子如：TNF-α、TGF-β1、IL-1β甚至生物活性多肽C3a均未观察到对HK2细胞C3aR表达造成影响。结论本实验不仅证明了肾小管上皮细胞表面表达生物活性肽段C3a受体(C3aR),而且还证明了炎症细胞因子IFN-γ能够明显增强肾小管上皮细胞其C3aR表达,预示着C3a/C3aR轴在肾脏疾病中参与了肾脏局部炎症反应的调节并且与糖尿病肾病的发生、发展有一定的相关。第二部分C3aR激动剂对小鼠原代肾小管上皮细胞表型影响的研究构建小鼠原代肾小管上皮细胞培养及鉴定的方法,探究C3aR活化是否能够引起小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化。方法首先,从小鼠肾组织中分离肾小管节段进行肾小管上皮细胞原代培养,步骤简述如下：小鼠处死消毒后于无菌环境中取出肾组织,肾皮质移入冷PBS中并切成1mm左右的碎片,之后肾皮质碎片移入5m1胶原酶溶液中,并在37℃摇床里震荡消化1h；让消化悬液通过孔径为100umm的尼农筛网,残留于筛网上的组织可以用无菌研钵轻轻碾压。用37℃PBS稍作冲洗后,再用37℃并含I%BSA的PBS液反向冲洗100umm尼农筛网,收集其冲洗液于干净离心管中,并以170g离心5min,得到的组织团块重悬于培养基中并接种于铺好胶原的12孔细胞培养板里,静置于标准的湿化孵育箱中(37℃、5%CO2)48h待肾小管节段贴壁,之后每两天更换一次培养基,约7天后细胞便会长满。将得到的原代肾小管上皮细胞传一代后,制作细胞爬片,并用免疫细胞化学及免疫荧光染色对上皮细胞进行鉴定。用C3aR激动剂与得到肾小管上皮细胞共培育,利用Real-time PCR和免疫印迹技术检测肾小管上皮细胞中E-cadherin、α-SMA及collagen Ⅰ的表达水平变化。用鬼笔环肽对上皮细胞行骨架染色,观察细胞骨架形态变化。结果肾小管节段悬液刚接入细胞培养板48h后,大部分小管节段贴壁,且有少量上皮样细胞从小管节段中向外爬出,随后细胞逐渐增多,呈岛状生长,细胞链接紧密,形态为多边形或短梭形,到第7天时,细胞长满孔底为细胞单层,呈典型鹅卵石铺路样,透明性折光性强。免疫细胞化学及免疫荧光染色结果显示细胞核周围及胞质E-cadherin染色均阳性,阴性对照组无特殊染色。C3aR激动剂能促进α-SMA和collagen Ⅰ表达上调而抑制E-cadherin表达,且三种分子各自的表达趋势与C3aR激动剂呈时间和剂量依赖关系,而细胞骨架染色结果显示,随着C3aR激动剂刺激时间的延长,上皮细胞内由肌动蛋白构成的应力纤维的生成逐渐增多。刺激时间大于12h时,应力纤维生成增加明显。结论我们成功构建了小鼠肾小管上皮细胞原代培养的方法,为以后对小鼠肾小管上皮细胞的研究提供了实验基础；我们也发现C3aR激动剂能够促进鼠肾小管上皮细胞表达α-SMA和collagen Ⅰ,然而抑制其E-cadherin的表达,还能使鼠肾小管上皮细胞应力纤维生成明显增加,表明C3aR活化能够促进肾小管上皮细胞发生上皮-间质细胞转分化,表明在肾脏纤维化的发生发展中起着一定程度的作用,也预示着C3aR可能成为肾脏疾病治疗的新靶点。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

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