精子钾离子通道的调节机制和功能研究

发布时间：2017-11-11 23:22

  本文关键词：精子钾离子通道的调节机制和功能研究

  更多相关文章： 小鼠精子 KSper NHE BPA CatSper 膜片钳 顶体反应 精子运动

【摘要】：研究背景和目的:随着现代生活方式和环境的改变,不孕不育呈现不断上升的趋势。目前,大约有15%的配偶存在不同程度的生殖障碍,其中约50%与男性有关,阐明精子功能调控机制是精准诊断与治疗男性不育的基础。精子进入雌性生殖道与卵子结合之前,必须经历获能、超活化、顶体反应等一系列复杂的变化过程,生理或环境因子所导致的其中任一步骤失常均可能影响最终的受精。KSper钾离子通道与CatSper钙离子通道是二种重要的精子特异性离子通道。KSper由主亚基Slo3和辅助亚基LRRC52组成。Slo3基因敲除雄性小鼠不育,而LRRC52敲除小鼠的生殖能力也严重受损,表明KSper是调控精子功能的关键因子。已知生理条件下精子胞内pH升高是激活KSper的关键因子。然而,有关精子胞内pH的调控机制、哪些分子通过调控精子胞内pH而激活KSper远未阐明。此外,环境因子是否能通过作用于KSper而影响精子功能也未见报道。根据精子上存在钠氢交换器(NHE)、其可能在精子的pH调控中起作用等文献报道,本研究试图阐明NHE是否是生理条件下调控KSper的重要分子;此外,本研究还试图阐明KSper是否介导了广受关注的环境内分泌干扰物双酚A(BPA)的精子功能损伤效应。通过本课题的研究,期望能够进一步阐明精子特异性通道KSper的调节机制及其功能,从而为深入认识精子功能调控机制、环境因子的精子损伤机制提供新的信息。实验设计:1、通过NHE抑制剂研究其在KSper激活中的作用。要求此抑制剂对KSper通道并无抑制或激活作用,才能保证所观察的效应来自NHE。基于KSper激活将因钾离子外流而导致细胞膜超极化这一特点,细胞膜电位的改变直接反映KSper抑制或激活、从而反映pH的改变。因此,通过膜片钳技术测定在不同pH的电极内液和不同缓冲能力的电极内液,检测NHE抑制剂对小鼠精子膜电位的影响,有望阐明NHE是否是通过调控pH而调控KSper通道的重要分子。此外还将通过CASA和顶体反应技术检测抑制剂对小鼠精子运动和顶体反应的影响。2、通过体内和体外实验检测BPA在不同浓度时对KSper离子通道表达和功能的影响。体内实验中通过喂养不同浓度的BPA三个月,然后检测构成KSper的主亚基Slo3蛋白的表达情况、KSper电流和精子运动与顶体反应。体外实验中则用不同浓度的BPA处理精子样品后,检测精子KSper通道的电流、运动和顶体反应情况。实验结果:1、筛选出对KSper通道无作用的NHE抑制剂:DMA;2、当胞内低pH缓冲时(电极内液未添加缓冲剂Hepes),生理外液中添加DMA显著导致小鼠精子膜电位去极化、表明生理条件下NHE对升高胞内pH、激活KSper具有重要作用;3、当胞内高pH缓冲时(电极内液含20mMHepes),生理外液中添加DMA对小鼠精子膜电位的去极化效应大大降低,进一步表明上述效应是由pH而不是其它未知因素介导的;4、胞内pH只影响精子的初始膜电位,但不影响DMA的去极化效应,提示两种情况下NHE均具有功能;5、荧光测量法表明DMA降低精子胞内pH,与上述结果一致;6、DMA显著抑制孕酮介导的小鼠精子顶体反应,但对小鼠精子运动和自发顶体反应无显著影响;7、喂养BPA的小鼠精子运动能力降低、顶体反应能力降低;但喂养小鼠精子的Slo3蛋白表达、KSper电流均未受影响;8、BPA直接孵育小鼠精子能损害精子运动、顶体反应等能力,但直接施加BPA不影响KSper电流,而抑制CatSper电流。结论:1、生理条件下NHE是调控精子胞内pH、并因此而调控KSper的重要分子。本实验为NHE通过调节pH来调控KSper离子通道提供了直接的实验证据,NHE抑制剂DMA通过抑制NHE转运体降低小鼠精子胞内pH,进而使小鼠精子由KSper介导的膜电位发生去极化;DMA对孕酮诱导的顶体反应的抑制可能与上述效应相关。2、环境干扰素BPA对小鼠精子的运动和顶体反应有明显的抑制,但是BPA对小鼠精子KSper的表达和功能无显著影响,其作用可能通过影响另一个精子特异性离子通道CatSper而实现。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R698.2

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本文编号：1173330