四因子诱导iPSCs方法的改良及大鼠肾脏固有细胞来源的iPSCs的获得

发布时间：2017-12-01 17:09

  本文关键词：四因子诱导iPSCs方法的改良及大鼠肾脏固有细胞来源的iPSCs的获得

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【摘要】：背景：近年来,慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)的发病率在世界范围内呈明显上升趋势。对于终末期肾脏病患者,主要的替代治疗方法是透析和肾移植。但是不论哪种方法都不能很好地维持其机体内环境的稳定,更不能替代肾脏的分泌功能,而且肾移植供体供不应求。组织工程与干细胞领域的突飞猛进为器官再生带来了希望。有研究表明利用小鼠脱细胞的肾脏细胞外基质作为骨架,通过肾动脉向骨架内灌注小鼠胚胎干细胞,发现胚胎干细胞可在骨架内定植,并能分化为相应的肾脏固有细胞。此前,我们课题组已成功获取大鼠脱细胞肾脏骨架并对其细胞相容性进行了检测。但是胚胎干细胞存在伦理问题。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)具有与胚胎干细胞类似的全能特性。利用iPSCs代替胚胎干细胞,不仅解决了伦理问题,同样在保持大量扩增能力的同时还具有胚胎干细胞的发育能力。目的：综合国内外加速体细胞重编程效率的有效方法改良iPS细胞的诱导效率,并提取原代的大鼠肾脏固有细胞,分别诱导为不同来源的iPS细胞,最后再灌注到脱细胞肾骨架中观察其生存情况。方法：(1)利用慢病毒载体结合抑制细胞的Mbd3基因,并在诱导培养基中加入维生素C加血清替代物,同时适当提高接种密度的方法改良iPS细胞的诱导效率;(2)分别提取并培养原代的大鼠肾脏系膜细胞、足细胞、血管内皮细胞、肾小管上皮细胞以及成纤维细胞等主要的肾脏固有细胞,分别诱导为不同细胞来源的iPS细胞,并做荧光标记;(3)将带有荧光标记的iPS细胞灌注到脱细胞肾骨架中观察其存活情况。结果：(1)利用改良过的iPS诱导方法成功将诱导周期由7天缩短至5天;(2)利用筛网及贴壁法,我们成功提取了主要的肾脏固有细胞,并分别用改良方法诱导成为各种不同细胞来源的iPS细胞,保留了对不同肾脏固有细胞的记忆性;(3)将带有RFP的大鼠iPS细胞灌入脱细胞肾骨架中,48小时后在双光子显微镜下观察其生长情况,结果示其生长状态良好。结论：(1)改良过的iPS细胞的诱导方法可缩短iPS细胞的诱导周期;(2)利用筛网及贴壁法,可成功提取主要的肾脏固有细胞,并且改良方法诱导也可成功将其诱导为各种不同细胞来源的iPS细胞,为下一步实验肾脏再生做准备;(3)大鼠iPSCs可以部分在脱细胞肾脏骨架内存活。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692

【共引文献】

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本文编号：1241822