内质网应激与氧化应激在膜性肾病中的作用及机制

发布时间：2017-12-10 01:05

  本文关键词：内质网应激与氧化应激在膜性肾病中的作用及机制

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【摘要】：目的:研究膜性肾病(membranous nephropathy,MN)发病过程中足细胞损伤机制,初步探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和氧化应激在MN发病过程中的作用。方法:SD雄性大鼠85只,随机分为5组:正常组(不预免,不免疫,其他实验组正式实验时予以隔日尾静脉注射1ml生理盐水(NS),同时NS1ml/d灌胃,n=20);模型组(按照改良的Border法予以C-BSA复制MN大鼠模型,同时NS 1ml/d灌胃,n=20);NAC1干预组(复制C-BSA MN大鼠模型,同时灌胃N-乙酰半胱氨酸(NAC)100mg/kg/d,n=20);NAC2干预组(复制C-BSA MN大鼠模型,同时灌胃NAC200mg/kg/d,n=20);NAC药物对照组(不预免,不免疫,其他实验组正式实验时予以隔日尾静脉注射1ml NS,同时灌胃NAC200mg/kg/d,n=5)。药物对照组在正式免疫后第1、2、3、4周末检测24h UTP,第4周杀检;其余组在正式免疫后第1、2、3、4周分别随机取5只大鼠杀检,并于处死前检测24h UTP;在各组杀检时心脏取血检查ALB、TG、TC等生化指标;采用分光光度法检测血清中的SOD、MDA;取大鼠肾脏分别进行光镜、电镜、免疫荧光鉴定成模情况及病理变化;用TUNEL法检测各组肾小球固有细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AI);免疫组化法检测各组肾小球中GRP78、TRAF2、Caspase12、WT-1蛋白不同时间点的半定量,并根据WT-1免疫组化结果计算足细胞密度;相关实验指标行Pearson相关分析。结果:⑴生化指标变化正常组各实验指标均正常;与正常组比较,模型组24h UTP、TG、TC呈时间依赖性升高,ALB随实验进展逐渐降低,24h UTP、ALB在第2、3、4周均有统计学意义(P0.05),TG、TC在第3、4周均有明显差异(P0.05);经过NAC治疗后,NAC1组、NAC2组24h UTP、TG、TC水平下降,ALB水平上升,第3、4周24h UTP较模型组均有显著性差异(P0.05),第4周ALB较模型组均有显著差异(P0.05),NAC2组TG于第4周接近正常,较模型组有明显差异(P0.05);药物对照组临床实验指标较正常组无明显异常。⑵肾脏形态学改变正常组与药物对照组肾脏颜色正常,未见明显形态学变化,无见电子致密物沉积,无免疫荧光沉积。与正常组比较,模型组随着实验进展,肾脏体积逐渐增大,色泽苍白,病理损害逐渐加重,肾小球毛细血管袢荧光强度逐渐增强;第4周时,模型组肾脏体积明显增大,边缘圆钝,呈“大白肾”样外观,光镜下见肾小球明显肿胀,少部分球囊腔狭窄,基底膜(GBM)弥漫性增厚,足细胞侧“钉突”形成,部分钉突顶部融合,呈“假双轨”结构,肾间质可见少许胶原纤维沉积,间质明显增宽,电镜下可见上皮下大量电子致密物沉积,毛细血管袢免疫荧光强度+++-+++++。与模型组比较,NAC1组、NAC2组病理损伤明显减轻,部分GBM增厚,呈“绸缎”样空泡变性,少量“钉突”形成,少许免疫复合物在上皮下沉积,未见明显“假双轨”改变,两组间免疫荧光强度较模型组稍减弱,但无显著性差异。⑶肾小球固有细胞凋亡的动态变化正常组与药物对照组罕见细胞凋亡;模型组肾小球细胞凋亡较正常组明显增多,第1、2、3、4周较正常组均有统计学意义(P0.05);与模型组比较,NAC1组、NAC2组肾小球细胞凋亡减少,第4周较模型组均有明显差异(P0.05),但仍均高于正常组(P0.05)。⑷足细胞密度变化正常组各时间点均无明显差异;与正常组比较,模型组第1周足细胞密度开始减少,但无统计学意义,第2、3、4周明显下降(P0.05);经干预治疗后,NAC1组、NAC2组足细胞密度较模型组略增大,于第4周出现明显差异(P0.05),足细胞密度增大与NAC剂量有一定关系,但整个治疗过程中同期比较均无统计学意义;与正常组比较,药物对照组第4周足细胞密度无明显差异。⑸血清中SOD、MDA变化与正常组比较,模型组大鼠血清中SOD表达量呈应激性升高,随后呈时间依赖性下降,第1、2、3、4周均有显著性差异(P0.05);模型组MDA呈升高趋势,第1、2、3、4周较正常组均有显著性差异(P0.05);经NAC干预后,NAC1组、NAC2组大鼠血清中SOD升高、MDA降低,在第3、4周较模型组均有明显差异(P0.05),第4周NAC2组MDA接近正常组。⑹肾脏组织免疫组化结果正常组大鼠GRP78主要集中在肾小管细胞胞浆表达,肾小球内表达较少;与正常组比较,模型组GRP78表达位置相同,肾小球GRP78表达在实验前3周呈时间依赖性升高,随后呈下降趋势,第1、2、3、4周较正常组均有统计学意义(P0.05);与模型组比较,NAC1、NAC2组肾小球GRP78表达减弱,第2周有明显差异(P0.05);与正常组比较,NAC1、NAC2组第1、2、3、4周均有统计学意义(P0.05)。正常组大鼠TRAF2表达量较少,主要集中在肾小球表达,近远端小管少量表达,集合管几乎不表达;与正常组比较,模型组肾小球TRAF2呈时间依赖性升高,第1、2、3、4周均有显著性差异(P0.05);Caspase12在正常组大鼠少量表达,主要定位在集合管和近远端小管细胞胞浆,肾小球少量表达;与正常组比较,模型组肾小球Caspase12呈时间依赖性升高,第2、3、4周均有统计学意义(P0.05)。经NAC抗氧化处理后,NAC1、NAC2组肾小球TRAF2、Caspase12表达均减弱,在第3、4周较模型组均有显著差异(P0.05),但仍较正常组升高(P0.05)。第4周药物对照组的GRP78、TRAF2、Caspase12表达位置同正常组,其在肾小球表达较正常组均无明显差异。⑺模型组各指标相关性分析24h UTP与肾小球AI呈正相关,与足细胞密度呈负相关;SOD与24h UTP、肾小球AI呈负相关,与足细胞密度呈正相关;MDA与24h UTP、肾小球AI呈正相关,与足细胞密度呈负相关;肾小球Caspase12与足细胞密度呈显著负相关,与肾小球AI呈正相关;肾小球AI与足细胞密度呈负相关。结论:⑴氧化应激与内质网应激参与大鼠膜性肾病发病。⑵在大鼠膜性肾病发病过程中,内质网应激早期可能通过未折叠蛋白反应起一定保护作用,晚期则可能通过活化TRAF2-Caspase12途径诱导足细胞损伤。⑶在大鼠膜性肾病发病过程中,氧化应激可能通过介导TRAF2-Caspase12途径的活化诱导足细胞凋亡。
【学位授予单位】：四川医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692

【共引文献】

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本文编号：1272518