线粒体损伤对囊肿衬里上皮细胞初级纤毛结构与功能的影响

发布时间：2017-12-20 23:39

  本文关键词：线粒体损伤对囊肿衬里上皮细胞初级纤毛结构与功能的影响　出处：《第二军医大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究目的：本研究旨在探索常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD)中是否存在线粒体损伤,并探讨线粒体损伤对初级纤毛结构和功能的影响及其可能机制,以进一步了解纤毛致病假说,并提供干预多囊肾病的新靶标。实验方法：1.多囊肾病中线粒体损伤的生物学验证(1)采用Western-blot及Real-time PCR方法检测多囊肾病动物模型pkd1-/-小鼠及正常对照pkd1+/+小鼠肾脏中、人多囊肾囊肿衬里上皮细胞(WT9-12)及正常肾小管上皮细胞(RCTEC)中热休克蛋白75(Heat shock protein 75, HSP75)、.线粒体内膜移位酶44(Translocases of the inner membrane 44, Tim44)、线粒体外膜移位酶20(Translocases of the outer membrane 20, Tim20)、细胞色素C的表达差异。(2)采用透射电镜观察WT9-12及RCTEC中线粒体的结构形态差异。2.多囊肾病中初级纤毛结构及功能异常的生物学验证(1)采用Western-blot方法检测pkdl-/+小鼠及pkdl+/+小鼠肾脏中、WT9-12及RCTEC中驱动蛋白2(Kinesin 2)、IFT88的蛋白水平表达差异。(2)采用Real-time PCR方法检测WT9-12及RCTEC中Kinesin 2的表达差异。(3)采用透射电镜、免疫荧光方法观察WT9-12及RCTEC中初级纤毛结构差异。3.HSP75对线粒体功能及初级纤毛结构和功能的影响研究(1)采用Western-blot方法检测WT9-12中转染质粒过表达HSP75后TIM44、TOM20、细胞色素C、Kinesin 2、IFT88的表达差异。(2)采用Western-blot方法检测RCTEC中siRNA干扰下调HSP75表达后TIM44、TOM20、细胞色素C、Kinesin 2、IFT88的表达差异。(3)采用化学发光法检测WT9-12中转染质粒过表达HSP75后、RCTEC中siRNA干扰下调HSP75表达后细胞内ATP含量的变化。(4)采用MTT法观察WT9-12中转染质粒过表达HSP75后、RCTEC中siRNA干扰下调HSP75表达后细胞增殖的变化。(5)采用激光共聚焦方法观察WT9-12中转染质粒过表达HSP75后、RCTEC中siRNA干扰下调HSP75表达后初级纤毛结构的变化。(6)采用流式细胞术方法检测WT9-12中转染质粒过表达HSP75后、RCTEC中siRNA干扰下调HSP75表达后细胞内钙离子浓度变化。结果：1. Western-blot及Real-time PCR方法检测发现pkd1-/-小鼠肾脏中HSP75、TIM44、TOM20表达较pkdl+／+小鼠减少,细胞色素C表达增多,WT9-12中得到相同结果。2.透射电镜观察发现与RCTEC比较,WT9-12中线粒体形态明显肿胀,线粒体嵴消失。3.免疫荧光发现与RCTEC比较,WT9-12中初级纤毛数量变少,长度变短甚至消失。4.WT9-12转染质粒过表达HSP75后TIM44、TOM20表达上调,细胞色素C表达下调,Kinesin2、IFT88表达上调。5.RCTEC siRNA干扰下调HSP75表达后TIM44、TOM20表达下调,细胞色素C表达上调,Kinesin2、IFT88表达下调。6.化学发光法检测ATP发现WT9-12转染质粒过表达HSP75后细胞内ATP量明显减少。RCTEC siRNA干扰下调HSP75表达后细胞内ATP量明显增加。7.MTT法检测发现WT9-12转染质粒过表达HSP75后促进细胞增殖,RCTEC siRNA干扰下调HSP75表达后抑制细胞增殖。8.激光共聚焦发现WT9-12转染质粒过表达HSP75后初级纤毛长度变长,RCTEC siRNA干扰下调HSP75表达后初级纤毛长度明显变短。9.WT9-12转染质粒过表达HSP75后细胞内钙离子浓度无明显差异,RCTEC siRNA干扰下调HSP75表达后72小时细胞内钙离子浓度明显减低。结论：本研究结果表明,多囊肾病模型鼠肾脏及人多囊肾囊肿衬里上皮细胞中存在线粒体损伤,且初级纤毛的结构和纤毛内转运功能存在异常,线粒体损伤可能通过能量代谢影响初级纤毛内转运蛋白功能,并导致初级纤毛长度变短,上调HSP75表达能够改善线粒体损伤,促进人囊肿衬里上皮细胞增殖,使初级纤毛长度变长；下调HSP75表达能够介导线粒体损伤,抑制正常肾小管上皮细胞增殖,使初级纤毛长度变短、调节钙离子内流功能异常。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692.11

【共引文献】

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1 李晓亮;肖燎原;徐志飞;;胶质瘤相关癌基因蛋白在肿瘤发生中的作用[J];现代生物医学进展;2014年27期

2 肖燎原;盛s，

本文编号：1313860