黄芪多糖对地塞米松和过氧化氢诱导骨骼肌细胞损伤的改善作用

发布时间：2018-01-26 02:47

本文关键词： 黄芪多糖骨骼肌肌管骨骼肌成肌细胞萎缩凋亡活性氧簇　出处：《南方医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：营养不良是慢性肾衰竭(Chronic renal failure, CRF)常见的重要并发症,亦是导致终末期肾病(ESRD)和CRF患者死亡率升高的主要原因之一。在我国,约20%-50%的CRF患者可以发生营养不良。CRF营养不良发病机制复杂,并且与免疫功能低下、感染、贫血、心血管事件等各种并发症密切相关,甚至导致多器官衰竭,严重影响患者的生存质量。目前临床治疗主要使用的类胰岛素生长因子1(Insulin-like growth factor1, IGF-1)注射和复方α-酮酸(开同),因其价格昂贵使其应用受到局限。因此,经济有效地预防、治疗CRF营养不良已成为医学领域中极为重要的问题。 CRF营养不良受多因素介导,营养物质摄入减少、代谢及内分泌紊乱、透析过程中丢失蛋白质、贫血、炎症等各种原因均可导致营养不良。骨骼肌萎缩导致的骨骼肌质量及体重下降是其重要指标。蛋白质代谢失衡是导致骨骼肌萎缩的根本原因,包括各种原因引起的合成代谢减少和分解代谢增加,其分子机制十分复杂。蛋白质分解代谢主要由四条途径介导：溶酶体途径(Lysosomal pathway),钙依赖性途径(Ca2+-dependent pathway),半胱天冬氨酸蛋白水解酶途径(Caspase-dependent pathway)和泛素蛋白酶体依赖性途径(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)。而与之相对的IGF-1可以通过上调蛋白激酶B/雷帕霉素把蛋白酶(Akt/mTOR)信号通路,磷酸化下游蛋白激酶入核,激活核内多种转录因子,促进相关mRNA翻译过程从而增强蛋白质合成。近年来研究证实在CRF营养不良过程中,不仅存在着蛋白质分解代谢增强,其合成代谢亦严重受到抑制,骨骼肌Akt, mTOR表达水平均明显降低。因此,探寻通过上调Akt/mTOR信号通路治疗CRF营养不良的新方法,寻找其作用更特异,有效的调控因子或环节,具有重要的临床意义。骨骼肌卫星细胞(Muscle satellite cell, MSC)是位于肌纤维膜与基底膜之间的一种单核多能干细胞,由于其在激活后能增殖分化成新的肌纤维,广泛参与骨骼肌组织的修复与再生,成为近年来研究的热点。静息状态下的MSC细胞器较少,染色质浓缩,细胞变现为静止和缺乏转录活性。当机体经受骨骼肌创伤等刺激后,静息态肌MSC的胞质发生扩张、激活,形成成肌细胞,并进一步分化、融合形成肌管,进而参与骨骼肌的修复。然而在CRF营养的环境下,此过程受到多方面的影响,包括尿毒症毒素,代谢性酸中毒,微炎症状态,营养元素缺乏等能抑制MSC的激活、生长、分化过程。其中氧化应激(Oxidative Stress,OS)反应普遍存在于上述影响因素中,是引起MSC损伤的重要一环。CRF营养的环境下产生过量的活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS),能与MSC和成肌细胞生物膜的上的磷脂、酶和膜受体发生反应,氧化机体的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质,损害细胞生物膜、细胞器、细胞核及各种代谢酶的功能,最终导致MSC及成肌细胞的损伤及凋亡,失去修复能力。由此可推断,清除机体内过量的ROS,降低OS反应水平,促进MSC的激活分、化过程,对骨骼肌萎缩延缓与修复具有重要意义。 CRF营养不良所致的骨骼肌萎缩,属于中医的“虚劳”、“痿症”的范畴。脾肾气虚是其发病基础。脾为后天之本,气血生化之源。因此“补脾益气”法在传统医学对CRF营养不良所致的骨骼肌萎缩的认识与治疗中有重要的地位。药用黄芪是豆科植物膜荚黄芪(Astragalus membranaceus (Fisch) Bge)和蒙古黄芪(Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus (Bge) Hsiao)的根,味甘,性微温,为常用中药材之一。我国药典记载其有补气健脾,益卫固表,利尿消肿,托毒生肌之功效,亦是历代医家在治疗“虚劳”、“痿症”时常用、重用之品。黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)为中药黄芪的水提多糖成分,是黄芪的主要生物活性成分。现代体内外实验及临床研究表明,APS对机体免疫功能紊乱、炎症状态、OS等具有调控改善作用,而这些状态与骨骼肌萎缩在病因和机制上密切联系,一些研究进一步证实了APS能够上调胰岛素抵抗状态下的骨骼肌细胞Akt表达,维持骨骼肌合成代谢水平。我们基于此猜想APS能够通过通过促进骨骼肌蛋白质合成,拮抗MSC氧化损伤,从而预防和改善骨骼肌萎缩状态。因此,本课题通过体外实验,观察APS对骨骼肌萎缩的改善作用,同时探索相关分子机制,为其临床应用提供实验依据。具体如下：第1章APS对C2C12肌管萎缩改善作用目的：观察APS对地塞米松(Dexamethasone, DEX)诱导C2C12骨骼肌肌管萎缩的保护作用,并探索其机制。方法：首先用含低浓度血清培养高密度骨骼肌C2C12成肌细胞,使其分化成C2C12肌管。之后用用含有1μM Dex的培养基培养骨骼肌C2C12肌管建立骨骼肌萎缩模型,并分为3组：Dex模型对照组,Dex+APS组,Dex+APS+LY组,另设正常对照组和APS对照组。Dex+APS组与APS对照组APS实验用量设定均为0.2mg/mL。 Dex+APS+LY组另加入磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)阻断剂LY294002(LY),浓度10μM。每组均孵育24h之后固定细胞,用伊红-苏木素(HE)法对各组进行染色,用200倍光镜对各组进行拍照,用Image Pro-Plus软件计算各组肌管的平均横径；用Western blot法检测各组磷酸化的Akt、mTOR、核糖体蛋白S6激酶(P70s6k)、核糖体蛋白S6(rpS6)、叉形头转录因子1(FoxO1)、叉形头转录因子3a (Fox03a)的表达含量。内参照采用GAPDH。结果：与正常对照组相比,Dex模型组肌管平均横径显著减小,APS干预可以改善横径减小程度,LY294002能够明显拮抗这种改善作用,减小C2C12肌管横径,以上组间的比较均有统计学意义(P0.05),而APS对照组与正常对照组之间肌管横径比较无差异；磷酸化的Akt、mTOR、P70s6k、rpS6、FoxO1、 Fox03a、rpS6在正常组中均有明显或零散表达,Dex模型组中磷酸化Akt、mTOR、 P70s6k、rpS6的表达量明显减少,FoxO1与Fox03a的表达含量显著增加,而APS能够恢复模型组以上信号因子的异常表达,LY294002能拮抗除FoxO3a以外所有APS对信号因子的恢复作用,以上组间的比较均有统计学意义(P0.05),而单加APS组与正常对照组之间相比,Akt、mTOR、P70s6k、rpS6、FoxO1、 Fox03a、rpS6的表达量均无差异。结论：骨骼肌萎缩状态下肌管横径减小,Akt/mTOR信号通路明显受到抑制。APS可有效调控恢复Akt/mTOR信号,增大肌管横径,从而改善骨骼肌萎缩状态。第2章APS对C2C12成肌细胞的增殖作用目的：观察APS和Dex对C2C12成肌细胞增殖率的影响。方法：观察浓度梯度APS对C2C12成肌细胞增殖率的影响：将培养的C2C12成肌细胞分成6组,分别用含不同浓度APS的培养基培养(0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL、lmg/mL、2mg/mL),另设空白对照组,分别孵育24h；观察时间梯度APS对C2C12成肌细胞增殖率的影响：将培养的C2C12成肌细胞分成4组,用含0.2mg/mL APS的培养基分别孵育8h、12h、24h、48h,每组均另设一组空白对照;观察Dex对C2C12成肌细胞增殖率的影响：将培养的C2C12成肌细胞分成5组,分别用含不同浓度Dex的培养基培养(0.1μm、1μm、10μm、100μm、1000μM),另设空白对照组,分别孵育24h；观察APS对过氧化氢诱导C2C12成肌细胞活性损伤的改善作用：将培养的C2C12成肌细胞分成空白对照组、过氧化氢组、APS组,过氧化氢组实验用量设定为200μM,APS组在此基础用0.2mg/mL药物干预,按8h、12h、24h孵育时间重复三次。用MTT法检测以上各组C2C12成肌细胞的增殖率及活性。结果：浓度梯度APS对C2C12成肌细胞增殖率的影响：与正常对照组相比,0.05mg/mL～0.5mg/mL的APS对C2C12成肌细胞具有显著的增殖效果,其中0.05mg/mL～0.2mg/mL段呈浓度-效应关系,2mg/mL的APS对C2C12成肌细胞增殖具有抑制作用,以上比较均有统计学意义(P0.05)；时间梯度APS对C2C12成肌细胞增殖率的影响：与正常对照组相比,12h-48h内APSC2C12成肌细胞具有显著的增殖效果,其中12h～24h段呈时间-效应关系,以上比较均有统计学意义(P0.05); Dex对C2C12成肌细胞增殖率的影响：与正常组相比,100μM及1000μM Dex能显著抑制C2C12成肌细胞增殖,比较有统计学意义(P0.05),而0.1μM、1μM、10μM Dex对C2C12成肌细胞增殖均无影响；APS对过氧化氢诱导C2C12成肌细胞活性损伤的改善作用：与正常组相比,过氧化氢干预12h和24h后能降低C2C12成肌细胞活性,APS对过氧化氢的干预效果有抑制作用,以上比较均有统计学意义(P0.05)。结论：APS在一定的浓度和时间内对C2C12成肌细胞的增殖有促进作用,并能改善过氧化氢诱导的C2C12成肌细胞活性损伤,Dex浓度小于10μM时对C2C12成肌细胞增殖无影响。第3章APS对C2C12成肌细胞抗凋亡及抗氧化作用目的：观察APS对过氧化氢诱导的C2C12成肌细胞凋亡及OS的改善作用,并探索其机制。方法：观察APS对过氧化氢诱导的C2C12成肌细胞凋亡的改善作用：将培养的C2C12成肌细胞分成4组,用含200μM和500μM过氧化氢的培养基培养,并分别用0.2mg/mL APS进行干预作为药物对照组,另设两组作为空白对照组,孵育24h后用PI/Annexin V染色法检测各组C2C12成肌细胞凋亡状况；探索APS抗凋亡的分子机制：将培养的C2C12成肌细胞分成过氧化氢模型组与APS干预组,过氧化氢模型组用量设定为200μM, APS干预组用量设定0.2mg/mL,并另设正常对照组和APS对照组,孵育24h后用Western blot法对各组Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、B淋巴细胞瘤-2基因相关蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达量进行检测；观察APS对ROS的影响：将培养的C2C12成肌细胞分成4组,用含200μM和500μM过氧化氢的培养基培养,并分别用0.2mg/mL和0.5mg/mL APS进行干预作为药物对照组,另设空白对照组,孵育30min后用DCFH-DA探针法检测ROS浓度。结果：APS对过氧化氢诱导的C2C12成肌细胞凋亡的改善作用：与正常对照组相比,200μM和500μM的过氧化氢组C2C12成肌细胞的凋亡率均明显上升,与模型组相比,经APS干预后能显著减少凋亡,以上比较均有统计学意义(P0.05)；探索APS抗凋亡的分子机制：与正常对照组相比,在过氧化氢模型组中,Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、Bax表达显著增加,Bcl-2表达减少。相对于模型组,APS能够显著下调Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、Bax表达,恢复Bcl-2表达量,以上比较均有统计学意义(P0.05); APS对ROS的影响：与正常对照组相比,200gM和500μM过氧化氢组中ROS浓度显著上升,0.2mg/mL和0.5mg/mL APS均能有效降低ROS浓度,以上比较均有统计学意义(P0.05)。结论：APS对过氧化氢诱导的C2C12成肌细胞凋亡及OS均具有改善作用,其机制可能是能通过调节caspase8/caspase3以及Bcl-2/Bax两条凋亡途径实现的。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R692.5

【参考文献】