miR-361-5p对前列腺癌发生发展的影响及其分子机制的研究

发布时间：2018-01-26 16:43

本文关键词：前列腺癌(prostate cancer) 雄激素依赖性前列腺癌(androgen-dependent prostatecancer ADPC) 去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer CRPC) microRNAs芯片 miR-361-5p 细胞增殖细胞周期细胞凋亡　出处：《东南大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：前列腺癌的具体病因目前尚不完全清楚。在疾病的早期几乎均为激素依赖性前列腺癌,去势治疗可缓解病情,几乎所有患者的病变都将逐渐发展为去势抵抗性前列腺癌。去势抵抗性前列腺癌变得难以控制并且更容易出现转移,己成为晚期前列腺癌患者主要的死亡原因,目前仍缺乏更为有效的治疗方法。在激素依赖性前列腺癌转变成去势抵抗性前列腺癌过程中有哪些指标发生了变化,以及这些因素在前列腺癌进展中起到了怎样的作用尚不明确。microRNAs (miRNAs)属于非编码RNA,主要通过在转录后水平调控基因表达。至今己发现的miRNAs有数百种,在人类基因组中,miRNAs调控大约1/3的蛋白编码基因,控制细胞的凋亡、增殖、分化、代谢以及个体的发育和肿瘤的发生、发展以及耐药。最近研究发现,超过50%的niRNA基因位于肿瘤相关基因组区或脆性位点,不但扮演了原癌基因或抑癌基因的角色,还可通过精细调节多条重要信号通路广泛参与到肿瘤的发生发展中。已有证据证明miRNA在前列腺癌的发生发展中起到重要作用。本研究旨在通过临床相关性研究分析出在激素依赖性前列腺癌与去势抵抗性前列腺癌中表达有差异性的miRNAs.其中niR-361-5p是我们所感兴趣的一重要的miRNA。进一步通过前列腺癌细胞功能实验验证niR-361-5p在前列腺癌细胞中所起到的作用。运用生物信息学和分子生物学相结合的手段,对miR-361-5p直接作用于STAT6/Bcl-xL途径促进前列腺癌细胞凋亡的分子机制进行丫阐述和验证。第一部分临床相关性研究：miR-361-5p在激素依赖性前列腺癌与去势抵抗性前列腺癌中表达的差异性研究目的：随着人口老龄化及诊断技术的进步,前列腺癌在我国发病率及检出率呈明显上升。前列腺癌初期多数为雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)最终将转变为去势抵抗性前列腺癌(CRPC),目前尚无有效的治疗手段。分子生物学方面的研究已经成为发现、诊断、治疗该疾病的热点,miRNA通过转录后调控基因的表达,控制细胞的凋亡、增殖、分化、代谢以及肿瘤的发生、发展。通过miRNAs芯片检测发现在早期ADPC与晚期CRPC组织中有差异性表达的miRNA,并进一步通过qRT-PCR和ISH实验检测验证。研究方法：新鲜手术标本在新鲜冰冻切片指示下收集早期雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)与晚期去势抵抗性前列腺癌(CRPC)组织在液氮中保存,取3例ADPC与3例CRPC组织行niRNAs芯片检测；继续通过qRT-PCR和ISH实验检测验证在早期ADPC与晚期CRPC组织中miR-361-5p的表达差异。研究结果：microRNAs芯片检测发现一些miRNA在早期ADPC与晚期CRPC组织中表达异常,其中niR-361-5p在后续的qRT-PCR和ISH实验验证均表明在CRPC中miR-361-5p的表达较ADPC中显著下降(P0.05)。研究结论：在CRPC中miR-361-5p的表达较ADPC中显著下降,提示miR-361-5p随着前列腺癌的进展而降低,可能是一潜在的重要的抑癌基因。第二部分miR-361-5p在前列腺癌中的功能性研究：miR-361-5p对前列腺癌细胞周期、凋亡、增殖、迁移、侵袭及体内成瘤的影响研究目的：文献报导在前列腺癌的发生发展中可能出现miR-361-5p的缺失,我们也推测miR-361-5p的表达降低可能参与前列腺癌细胞由激素依赖向去势抵抗性的转化,但miR-361-5p在前列腺癌中的具体作用尚无系统的相关功能实验验证报道。通过体外细胞功能实验以及体内裸鼠皮下成瘤实验,探讨miR-361-5p对去势抵抗性前列腺癌细胞DU145与PC3的细胞周期变化、细胞凋亡比例、细胞增殖能力、细胞迁移和侵袭能力的影响,以及裸鼠活体皮下成瘤能力的影响。研究方法：体外功能实验在去势抵抗性前列腺癌细胞DU145与PC3中转染niR-361-5p mimics与NC后通过细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit, CCK-8)实验检测细胞增殖活性变化；低密度细胞集落形成实验检测前列腺癌细胞转染1niR-361-5p mimics与NC后细胞形成克隆的能力；转染miR-361-5p mimics与NC后的前列腺癌细胞采用流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡情况；转染miR-361-5p mimics与NC后的前列腺癌细胞采用Transwell迁移和侵袭实验检测前列腺癌细胞穿透Transwell小室的能力变化；体内实验采用裸鼠皮下成瘤实验进一步验证miR-361-5p对前列腺癌细胞体内形成肿瘤能力的影响,移植瘤标本采用免疫组化法检测Ki-67、CD34的表达变化,进一步佐证miR-361-5p对前列腺癌细胞增殖及微血管形成的影响。研究结果：CCK-8实验结果表明在DU145和PC3细胞中转染niR-361-5p mimics与NC组相比miR-361-5p能够明显抑制前列腺癌细胞增殖(P0.05)。在低密度细胞集落形成实验中转染miR-361-5p mimics与NC组相比miR-361-5p可以显著抑制细胞形成克隆的数目和大小(P0.01)。采用流式细胞仪检测结果发现转染niR-361-5p mimics与NC组相比]miR-361-5p能够致使前列腺癌细胞周期被阻滞在G1期的比例明显升高(P0.01),并显著增加前列腺癌细胞凋亡的比例(P0.01)。在Transwell迁移和侵袭实验中,转染miR-361-5p mimics与NC组相比转染miR-361-5p后可致通过Transwell小室的细胞数量明显减少(P0.01)。裸鼠成瘤实验中,转染miR-361-5p的细胞裸鼠皮下肿瘤的大小明显小于对照组(P0.01),移植瘤病理切片免疫组化提示Ki-67、CD34的表达均降低。研究结论：miR-361-5p能够抑制CRPC细胞DU145和PC3的增殖、迁移能力,阻滞细胞在G1期,并促进细胞凋亡,从而发挥抑癌基因的作用。第三部分分子机制研究：miR-361-5p直接作用于STAT6/Bcl-xL途径促进前列腺癌细胞凋亡研究目的：通过生物信息学分析,预测出信号转导和转录激活因子-6(Signal transducer and activator of transcription-6, STAT6)可能是niR-361-5p在前列腺癌中的潜在靶基因。我们试图通过相关实验进一步验证STAT6在前列腺癌中的作用；以及进一步实验验证miR-361-5p能够与STAT6的3’-UTR直接结合抑制STAT6的表达；B细胞淋巴瘤放大因子(B-cell lymphoma-extra large, Bcl-xL)是Bcl-2家族的一重要成员,是重要的促细胞存活和抑制细胞凋亡因素,进一步实验证实在前列腺癌中STAT6能够与Bcl-xL的启动子区域结合促进Bcl-xL的表达。研究方法：采用生物信息学检索和预测；依据所检索和预测到的可能结合的种子序列区域构建双荧光素酶报告基因质粒(STAT6 psiCHECK-2 reporter)载体,荧光素酶报告基因实验及蛋白质免疫印迹法(Western Blotting)实验验证在前列腺癌中miR-361-5p对STAT6的作用；依据所检索和预测到的STAT6与Bcl-xL启动子区域结合的序列构建荧光素酶报告基因质粒(Bcl-xL pGL3-basic reporter)载体,荧光素酶报告基因实验及Western Blotting实验验证在前列腺癌中STAT6对Bcl-xL表达的影响；采用裸鼠皮下成瘤模型实验验证niR-361-5p对体内成瘤的影响,所形成的移植瘤采用免疫组化法进一步检测STAT6、Bcl-xL的表达情况。研究结果：通过生物信息学检索和预测、荧光素酶报告基因实验以及Western Blotting实验研究结果均表明：在前列腺癌中miR-361-5p可直接与STAT6的3’端非翻译区域(3'-untranslated regions,3'-UTR)结合,miR-361-5p皂够对STAT6起直接靶向抑制作用。细胞功能实验证实在前列腺癌中STAT6起到重要促癌作用。荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和Western Blotting实验验证在前列腺癌中STAT6能够促进Bcl-xL的表达。裸鼠成瘤实验中,转染miR-361-5p的细胞裸鼠皮下肿瘤的大小明显小于对照组(P0.05),移植瘤病理切片免疫组化提示STAT6、Bcl-xL的表达降低。研究结论：STAT6是miR-361-5p的直接靶基因,STAT6在前列腺癌中起促癌作用,miR-361-5p可通过抑制STAT6降低Bcl-xL的表达。
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【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25

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