沉默PCAF基因对肾上腺皮质癌细胞株SW-13生物学行为的影响及其机制的初步研究

发布时间：2018-01-31 05:37

本文关键词： PCAF 肾上腺皮质癌增殖凋亡血管生长　出处：《南方医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：[背景] 肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma, ACC)是原发于肾上腺皮质的恶性肿瘤,临床罕见,约占全身恶性肿瘤的0.02%。ACC恶性程度高,侵袭能力强,早期诊断困难。目前采用改良的Weiss鉴别肾上腺皮质良恶性肿瘤,但肾上腺皮质腺瘤和ACC的组织结构和形态相似,在没有周围组织浸润和远处转移征象时,病理诊断也难区分肾上腺皮质癌和肾上腺皮质腺瘤,故临床上出现误诊的病例也不少见。ACC早期即可出现远处转移,术后复发率高,平均生存期约18个月。缺乏有效的药物治疗,根治性切除肿瘤仍然是国内外治疗ACC的首选治疗方式。虽然在生物分子领域对ACC的发病机制取得了一定的成就,临床病例所得的ACC患者血清学标志,基因突变等指标也有新的进展,但仍未发现ACC的特异性靶基因,没有找到准确的治疗靶点,这也是ACC诊断和治疗的一个难点。肾上腺皮质癌是一个多基因相关肿瘤,涉及多条信号通路,发病机制较为复杂,且因人种和地区等因素差异而表现不同。目前明确的发病机制有两种,其一为Li-Fraumeni综合征,一种罕见的家族性综合征,与广谱的肿瘤如乳腺癌、肾上腺皮质癌、白血病等有关,是由于基因突变导致抑癌基因P53的失活,从而促进肿瘤的形成。其二为Beckwith-Wiedemann综合征伴发疾病,该综合征主要原因是发育缺陷,表现为脐膨出,巨大舌和身体一侧生长过剩,少部分患儿伴发肾母细胞瘤、肝母细胞瘤、肾上腺皮质癌等肿瘤。基因突变的位置为1lp15,该位点的基因包括IGF-2, H19, and p57Kip2。也有证据表明ACC中APC抑癌基因突变,与胃肠道肿瘤综合征-腺瘤性息肉病(APC)发病机制相同。Gicquel等研究发现,肿瘤突变的位点为17p(包含p53基因)及11p15(包含IGF-2/CDKN1C基因),而且这些突变与良恶性相关,缺失17p和重组llp15与恶性表型有显著相关,可以作为区分良恶性肿瘤的重要指标。IGF-2基因及其靶向分子药物是目前研究散发性ACC靶向治疗的主体,其中GALACCTIC研究就是针对IGF1R而进行的一个135例样本的系统研究。但上述研究所发现的与ACC发生发展可能相关基因的研究仍然比较模糊,对ACC的诊断治疗无明显临床价值,所以寻找可靠靶点对ACC的诊断和治疗仍然十分重要。 PCAF (P300/CBP Associated Factor)为共激活辅因子核蛋白,是重要的细胞周期调控蛋白,能于多种基础转录因子和多种DNA结合因子联结相互作用,介导基因转录,起桥梁、支架和乙酰基转移酶作用。PCAF基因在肿瘤中的研究尚是一个新的领域,目前的研究表明,PCAF参与细胞分化、凋亡与肿瘤形成,同时PCAF可能参与肿瘤血管的生成以及肿瘤细胞的迁移,部分肿瘤中PCAF活性受到抑制,而也有肿瘤中报道PCAF在肿瘤中呈高表达。所以PCAF与肿瘤的发生、发展的关系仍处于争议中。关于PCAF的基础研究中发现PCAF是肿瘤抑制基因p53的共激活子,PCAF通过组蛋白乙酰化结合的p53和含有p53靶启动子的组蛋白转化激活p53的靶基因。有学者运用微阵列技术方法发现PCAF在一组乳腺癌细胞系中可以被p53所诱导。两种p53突变的乳腺癌细胞系BT-549和UACC-1179用于研究野生型p53诱导的PCAF,通过Real-time PCR的方法证实PCAF的表达被p53的腺病毒转导所诱导,并呈时间依赖性。染色质免疫沉淀实验显示PCAF的诱导与p53与PCAF启动子的结合具有相关性,而这些启动子区含有p53的共结合位点。P53活动所诱导的PCAF的表达在p53野生型的MCF10A细胞系中得到证实。实验发现,PCAF的表达被内源性的野生型p53通过剂量和时间依赖性的方式所诱导。针对p53的mRNA对MCF10A进行预处理,可以发现柔红霉素所诱导的PCAF的表达增加。简言之,PCAF的表达可以被野生型P53所诱导。同时p53抑制肿瘤细胞的功能需要DNA损伤和缺氧环境的作用,缺氧条件下p53激活由P300/CBP作用的的K382位点减弱,而PCAF作用的K320位点增强,使K320位点激活的P53可以结合p21WAF-1/cip-1基因启动子,促进它的转录,但不能结合P53下游的凋亡基因BID启动子。在缺氧条件下PCAF还通过乙酰化激活HIF-1α基因,为细胞提供能量,促进细胞的增殖,推进细胞周期进程。总之PCAF在缺氧条件下通过乙酰化P53和HIF-1α之间的平衡,来维持细胞周期阻滞和凋亡的平衡。PCAF还可以调节尿路上皮癌细胞(KK47、T24)中Y-box binding protein-1(YB-1)基因的转录, Masaki Shiota等敲除PCAF基因后发现YB-1表达水平下调,抑制癌细胞的增殖和降低癌细胞的迁移和侵袭能力。该研究选择的是顺铂不敏感的肿瘤细胞,并推测PCAF、YB-1可能作为这些肿瘤治疗的靶点。近几年临床肿瘤标本中发现,PCAF在多种肿瘤组织或肿瘤细胞系中呈表达降低或不表达,包括食管鳞状细胞癌、乳腺癌、肝癌等,PCAF表达降低或不表达的肿瘤细胞系包括：Ovmana、OVI-P等,而造成PCAF表达降低的原因包括基因组的杂合性缺失、启动子的甲基化及突变等。而PCAF在小儿中枢神经系统肿瘤、肾母细胞瘤以及前列腺癌等中高表达,可能与肿瘤的发生、发展有促进作用。这可能与PCAF可激活肿瘤中VEGF及HIF-1α通路,从而促进肿瘤的增殖生长。综合最新的研究进展,PCAF是细胞内的一种乙酰基转移酶,主要作用是乙酰化组蛋白。通过激活组蛋白的相关位点来促进基因的转录,但所激活的基因中既有抑癌基因,又有原癌基因。上述从基础研究到临床标本的研究可以发现,PCAF所激活的基因随肿瘤的不同而不同。本研究基于此研究背景,检测肾上腺皮质癌细胞株中PCAF的表达水平,建立过表达或干扰的稳定细胞株后分别在细胞水平、分子水平、蛋白水平检测PCAF对肾上腺皮质癌细胞的影响,并探讨其作用机制。 [目的] 构建pLentii6.3-PCAF慢病毒重组载体,建立PCAF下调的稳定细胞株。观察其对肾上腺皮质癌SW-13细胞增殖、细胞周期、凋亡及侵袭等的影响。筛选相关基因并进行荧光定量PCR分析和Western blot验证,并对相关基因进行组蛋白CHIP实验验证,探索相关信号通路的调控机制。 [方法] 1.选取15例广州军区总医院肾上腺皮质癌石蜡病理切片,6例正常肾上腺组织及32例肾上腺皮质腺瘤进行免疫组化实验检测PCAF的表达情况,采用秩和检验统计结果。另外取肾上腺皮质癌的手术标本,与正常的肾上腺皮质腺瘤对照进行qPCR检测。 2.构建含PCAF干扰序列的慢病毒载体pLentii6.3-PCAF,通过病毒感染进入细胞株,经过抗性筛选建立PCAF下调的稳定细胞株,western blot及qPCR检测均见实验组、阴性对照组及空白对照组PCAF表达情况。 3.设立空白组、阴性对照组(转染pLentii6.3载体)及实验组(转染pLentii6.3-PCAF载体)3组,进行细胞增殖能力检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测及细胞迁移、侵袭能力检测。 4.通过上述的检测结果筛选出相关的蛋白及通路进行western blot及qPCR检测三组水平的变化。检测beta-catenin、CD44、MMP-7, P53、PUMA、BAX、 BCL-2、Caspase-9, VEGF-A、HIF-1α、cyclinA、cyclinB、cyclinD1、cyclin El在对照组和实验组间出现相应改变。 [结果] 1.选取病理石蜡切片分为肾上腺皮质癌组(ACC组)、肾上腺皮质腺瘤组(ACA组)及正常肾上腺组织组(NAG组)3组。SP法进行免疫组化检测得出PCAF主要表达于细胞核,且ACC组的表达明显高于ACA组和NAG组,差异具有统计学意义(P0.05)。qPCR检测肾上腺皮质癌组中PCAF水平约为肾上腺皮质腺瘤组的2.15倍。 2.构建含PCAF干扰序列的慢病毒载体pLentii6.3-PCAF,建立PCAF下调的稳定细胞株后,经Western blot检测实验组较对照组表达明显下降(P0.05)。qPCR检测实验组PCAF表达水平为0.332倍。 3.CCK-8检测细胞增殖率发现实验组增值率较对照组及空白组低(P0.05)。TUNEL原位凋亡法检测细胞凋亡率,实验组凋亡率较对照组及空白组高(P0.05)。划痕实验检测细胞迁移能力,transwell检测细胞侵袭能力发现实验组迁移、侵袭能力较对照组及空白组低(P0.05),但三组细胞周期未发现有统计学意义的差异。 4.根据细胞水平的结果,选择western blot检测相关蛋白检测：①Wnt/beta-catenin通路相关蛋白的检测,实验组中变异的beta-catenin蛋白及转移蛋白MMP-7较对照组及空白组降低,而粘附蛋白CD44则出现升高(p0.05)。②线粒体凋亡通路相关蛋白的检测。实验组的P53、puma、bax、caspase-9等凋亡相关蛋白水平较对照组及空白组升高,而抗凋亡蛋白bcl-2则出现下降(p0.05)。③血管通路相关蛋白的检测。VEGF-A及HIF-1α在实验组中的表达水平较对照组及空白组中低(p0.05)。 5. qPCR检测上述蛋白mRNA水平,同时也检测细胞周期相关基因的表达情况。qPCR结果与Western blot结果是一致的,细胞周期相关基因的表达在三组间比较未发现有统计学差异的结果。 [结论] 1. PCAF在肾上腺皮质癌中高表达,可能促进肿瘤的发生、发展。 2、下调PCAF基因激活P53/PUMA-BCL-2/caspase-9凋亡相关基因的转录,抑制wnt/β-catenin通路和VEGF/HIF-1通路的激活,可能引起肾上腺皮质癌SW-13细胞在体外生长、迁移和侵袭能力下降。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.11

【参考文献】