miR-195在前列腺癌转移中的作用及其表达调控机制

发布时间：2018-02-09 10:20

本文关键词： 前列腺癌 miR-195 FGF2 NF-κB1 上皮间质转化　出处：《东南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分miR-195在前列腺癌转移及上皮间质转化中的作用目的：研究miR-195在转移前列腺癌及非转移前列腺癌之间表达的差异,miR-195表达在转移前列腺癌的诊断以及前列腺癌术后生化复发中的作用。明确miR-195在前列腺癌转移及上皮间质转化(epithelia-mesenchymal transition, EMT)中的作用及机制,为前列腺癌转移的机制提供理论基础和试验依据。方法：对Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC)数据库中获得的关于前列腺癌miRNA表达的基因芯片数据进行二次分析,比较其在转移及非转移前列腺癌中的表达差异。分析miR-195在转移前列腺癌诊断作用及其与非转移前列腺癌生化复发的关系。通过原位杂交检测miR-195在转移及非转移前列腺癌中的表达。通过Transwell迁移和侵袭实验明确miR-195对前列腺癌细胞转移的作用,通过Western bloting检测上皮间质转化相关蛋白标志物的变化,明确miR-195对上皮间质转化的调控作用。通过荧光素酶报告基因及Western bloting证实碱性成纤维因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF/FGF2)是miR-195的靶基因。然后通过小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)抑制FGF2的表达,Transwell迁移和侵袭实验检测低表达FGF2对前列腺癌细胞转移的影响,Western bloting检测上皮间质转化相关蛋白标志物的变化。在高表达miR-195的细胞中应用人重组FGF2后,Transwell迁移和侵袭实验检测前列腺癌细胞转移能力,Western bloting检测上皮间质转化相关蛋白标志物的变化。最后通过免疫组化检测转移及非转移前列腺癌组织中FGF2的表达。结果：对MSKCC数据库资料的二次分析表明,miR-195在转移前列腺癌中的表达低于非转移前列腺癌。接受者操作特性曲线(Receiver-operating characteristic curve, ROC)分析表明miR-195能够用于转移前列腺癌的诊断,其曲线下面积(Area under the curve, AUC)为0.705,95%置信区间为0.507-0.903,P=O.017。原位杂交显示,miR-195在转移前列腺癌组织中的表达低于非转移前列腺癌组织。在前列腺癌细胞中高表达miR-195能够抑制细胞的迁移和侵袭能力,同时上皮间质转化常见标识蛋白波形蛋白(vimentin)和N-钙粘素(N-cadherin)水平降低,E-钙粘素(E-cadherin)水平升高。报告基因及Western bloting结果表明FGF2为miR-195的直接靶基因。通过siRNA抑制FGF2的表达后,前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力下降,波形蛋白和N-钙粘素水平降低,E-钙粘素水平升高。而在高表达miR-195的前列腺癌细胞中应用人重组FGF2处理后,前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力明显恢复,应用人重组FGF2也使波形蛋白和N-钙粘素水平升高,E-钙粘素水平降低。免疫组化显示,FGF2在转移前列腺癌组织中的表达高于非转移前列腺癌组织。结论：miR-195在转移前列腺癌患者组织中的表达低于非转移患者,miR-195能够用于转移前列腺癌的诊断。体外实验证明,miR-195能够通过FGF2抑制前列腺癌细胞的上皮间质转化,降低前列腺癌细胞的侵袭和迁移能力。第二部分NF-κBl调控miR-195的表达目的：明确核因子κB1 (Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells1,NF-κB1)能够抑制前列腺癌中miR-195的表达。方法：通过生物信息学数据库JASPAR (http://jaspar.genereg.net/)预测可能调控miR-195表达的转录因子。通过实时定量PCR (real time quantitative PCR)筛选抑制miR-195表达的转录因子。接着通过荧光素酶报告基因及电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)证实转录因子NF-κB1与miR-195启动子区的直接结合。在前列腺癌细胞中应用siRNA技术抑制NF-κB1的表达,实时定量PCR观察miR-195的表达。最后通过原位杂交检测前列腺癌组织中miR-195的表达,免疫组化检测NF-κB1的表达,并分析两者之间表达的相关性。结果：通过JASPAR数据库预测,我们猜想血清效应因子(serum response factor, SRF)、早期生长反应因子1 (early growth response 1, EGR1)/Sp1转录因子(Spl transcription factor, SP1)、NF-κB1、KLF5(Kruppel-like factor 5)、叉头框蛋白P1 (forkhead box P1,FOXP1)、Fli-1原癌基因(Fli-1 proto-oncogene, FLI1)可能调控miR-195的表达。实时定量PCR表明,SP1、EGR1、KLF5、FOXP1、FLI1局表达后miR-195在PC-3细胞中的表达量增高,而高表达NF-κB1、SRF后PC-3细胞中miR-195表达量降低。在起抑制作用的转录因子中NF-κB1的转录抑制作用最大。荧光素酶报告基因和EMSA实验证实前列腺癌中存在NF-κB1与miR-195启动子区的结合。而在前列腺癌细胞中通过siRNA抑制NF-κB1表达后miR-195表达升高。原位杂交和免疫组化的结果表明,NF-κB1的表达与miR-195的表达呈负相关。结论：NF-κB1在前列腺癌中抑制miR-195的表达。
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【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25

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