MAPK信号通路在老年患者腹腔镜根治性膀胱切除预后中的作用及其对BIU87膀胱癌细胞株凋亡的影响

发布时间：2018-02-10 16:01

本文关键词： 膀胱癌丝裂原活化蛋白激酶腹腔镜膀胱根治性切除术增殖凋亡　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的：探讨膀胱癌发病的风险因素及膀胱癌患者癌组织MAPK的表达水平与临床预后的关系,评价腹腔镜根治性膀胱切除术的安全性和的有效性,探讨MAPK基因对BIU87膀胱癌细胞株增殖及凋亡的生物学作用。方法：第一部分：汉族人群膀胱癌高危因素及外周血MAPK表达水平分析(1) 自2010年1月至2015年1月,在我院泌尿外科收集42例年龄70岁老年膀胱癌患者以及89例年龄小于70岁的膀胱癌患者共131例；在我院体检中心收集年龄,数量,性别比例匹配的健康人为健康对照；(2)对入组患者及健康对照者吸烟史,饮酒史,有毒作业情况等进行记录及统计学分析,使用Logistic及单因素对可能的致癌因素进行总结和归纳；(3)使用酶联免疫吸附试验检测患者及健康对照者外周血MAPK表达水平并进行统计学分析。第二部分老年膀胱癌患者腹腔镜根治性膀胱切除术的短期及长期预后观察(1)将入组的膀胱癌患者按照年龄分为70岁以上及70岁以下两组。使用腹腔镜根治性膀胱切除术对两组患者进行治疗；(2)随访观察治疗的安全性,手术成功率,复发率,术后生存情况；(3)术中留取癌组织及癌旁组织进行免疫组化染色,检测癌组织及癌旁组织中MAPK表达水平,对阳性面积百分比进行统计分析；第三部分MAPK在膀胱癌中的作用机制研究(1)构建MAPKshRNA,转入膀胱癌细胞BIU87中；(2)使用流式细胞仪检测膀胱癌细胞凋亡及细胞周期；(3) western blot检测细胞Bax/Bcl-2表达水平；(4) transwell小室法检测膀胱癌细胞侵袭力；结果：第一部分：1.对131名膀胱癌患者的性别,年龄,体重,BMI等一般临床指标进行记录与统计分析,结果发现,与131名健康对照相比,患者的BMI明显增高,差异具有统计学意义(P0.05)。在年龄,体重等方面,未发现明显统计学差异(P0.05)。2.临床病史分析主要包括以下几个基本病史：性别,家族史,放射线接触史,吸烟史,饮酒史,有毒物质接触史,高脂饮食史等。我们发现,膀胱癌患者中,高脂饮食,有毒物质接触,及有膀胱癌家族史的患者明显多于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。3.对131名膀胱癌患者及健康对照者的外周血MAP K表达水平进行比较,结果发现,与对照组相比,病例组中外周血MAPK表达水平明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。4.进一步在病例组中比较年龄70岁与年龄≤70岁的膀胱癌患者外周血MAPK表达水平,两组未发现明显统计学意义(P0.05)5.我们对患者进行超声检查发现,70岁老年患者平均肿瘤体积为(6.9±2.1)cm3,≤70岁老年患者平均肿瘤体积为(6.3±1.9)cm3,两组相比,差异未见明显统计学差异(P0.05)。6.以年龄、性别是作为配比的条件,对膀胱癌患者组与健康对照组进行均衡性检验,结果显示年龄组(P=0.2410.05),性别组(P=0.8940.05)在两组比较均无统计学意义,年龄、性别均衡,组间具有可比性。7.对病例组与健康对照组进行组间相关性的显著性检验,判断与疾病密切相关的病因因素。由于变量较多,首先采用单因素分析,发现在我们关注的纳入的可疑因素中,有7项是与研究疾病有关联的。受教育程度和职业属于等级分类指标,采用了秩和检验。由表1-10,1-11可知：吸烟(P0.001)具有统计学意义。8.使用方差齐性检验对高脂饮食时间、血糖等数据进行统计学分析。将数值输入SPSS 20.0统计学软件中得出结果(见表1-11),结果发现,高脂饮食时间具有统计学意义,而血糖无统计学意义(P0.05)。9.受教育程度非两项分类,而是用等级分类,对此采用秩和检验,见表1-12结果显示：Z=1.8391.96,P=0.0480.05差别无显著性,无统计学意义,说明受教育程度是膀胱癌发生的危险因素之一10.进一步对职业性质进行秩和检验,结果表明,P0.001,说明两组间差别具有显著性,职业是的膀胱癌相关因素之一11.经显著性检验后,在本次入组的患者中最终确认5项为膀胱癌发生的的相关危险因素。为进一步探讨相关因素与的相关性,矫正混杂因素。将多种变量纳入多因素分析,最终导入非条件Logistic回归模型。以膀胱癌发生为自变量,相关因素为因变量,采用后退法再逐个进行筛选,选入变量的概率标准为0.05,剔除标准为0.05。结果表明,家族史、吸烟、职业性质,有毒物质接触时间,受教育程度具有统计学意义(P0.05)。12.对膀胱癌患者各种影响因素和MAPK表达水平之间做COX多因素回归模型分析结果,结果发现,在膀胱癌患者中,血清MAPK水平和BMI, TNM分期,淋巴结转移有关,差异具有统计学意义(P0.05)。第二部分：1.在老年组患者的平均年龄为73岁,非老年组平均年龄为58岁(范围37-69岁；P=0)。老年患者中ASA评分Ⅱ级者数量众多(50% vs 20.2% P=0.001),合并症发病率明显高于非老龄组(73.8% vs 21.3%,P=0),特别是高血压(23.8%vs 9%,P=0.021)和2型糖尿病患者(19% vs 5.6%,P=0.037)明显多于非老龄组。与非老龄组相比,老龄组患者ASA评分I级者数量较少(45.2%和78.7%, P=0)。2.手术过程和90天的术后并发症情况。两组手术时间、术中出血量、输血量、术后恢复时间、术后住院时间及术后90天并发症无显著性差异。任何患者均未在术后90天内发生死亡。老年组患者接受辅助化疗者较非老年组稍增多,但差异不显著(P=0.055)。3.两组的中位随访时间相似。长期预后的评价如图2-1和2-2所示。老年和非老年患者的5年生存率组间差异无统计学意义(P=0.274),5年无病生存率(P=0.110)无明显统计学差异。老年组有21.3%患者肿瘤复发,非老年组患者中,复发率为33.3%。首次复发的时间的位置之间没有显着差异。多因素分析显示,肿瘤浸润深度和淋巴结转移与0S之间的关系见表2-5。多因素分析显示,肿瘤浸润深度、肿瘤分级、淋巴结转移与DFS明显相关。4.免疫组化染色发现,MAPK在膀胱癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P0.05)。第三部分：1.为了探讨MAPK在BIU87细胞中的功能,我们构建shRNA质粒,并最终发现转染后细胞中MAPK表达下调。我们根据需要共构建了三对人MAPK基因的shRNA序列和一种非特异性拮抗shRNA序列作为阴性对照,并克隆到慢病毒载体中。重组慢病毒并包装进入HEK-293T细胞。BIU87细胞随后被感染MAPK的RNAi或阴性对照病毒中。使用Western印迹法和实时荧光定量PCR证实了使用RNAi沉默MAPK的结果如图2-3A。MAPK-Ri-3被确定为最有效的感染类型,我们选择他们进行后续实验。2.在转染MAPK-Ri-3病毒的细胞中,与野生型细胞(WT)和shRNA拮抗的病毒感染细胞(NEG)相比,细胞黏附性降低,因此其生长情况明显受损。这些数据表明,MAPK表达增加可以促进膀胱癌细胞的增殖过程,而抑制MAPK后,膀胱癌细胞增殖受阻。3.与WT(46.2+2.8%)和阴性对照组相比(44.9+1.7%),MAPK表达受阻可以抑制细胞增殖,并导致G1期细胞数明显增高(64.9+2.9%)而S期和G2-M期细胞数量明显减少。这些数据提示MAPK受阻可使细胞周期阻滞于G1期,这可能与MAPK-Ri-3细胞增殖受阻有关。4.在MAPK-Ri-3细胞中,凋亡率增加到49.6+1.5%,与WT相比(4.3士0.5%)和阴性对照组(5.0±1.0%)。差异具有统计学意义(P0.05)。这些数据提示MAPK可能在膀胱癌细胞中发挥着抗凋亡作用。5.MAPK沉默细胞与对照细胞相比,其侵袭能力显著降低。MAPK-Ri-3细胞的侵袭细胞百分比为44%。(WT,121±14;阴性对照,118±13; MAPK-Ri-3,44+7)。结论：吸烟,职业以及教育背景可能是影响汉族膀胱癌患者发病的高危因素；MAPK在膀胱癌患者外周血及癌组织中高表达,在老年及非老年患者中,腹腔镜膀胱癌根治术对于二者同样安全有效。MAPK可能通过Bax/Bcl-2调节膀胱癌细胞的增殖及凋亡及细胞周期,MAPK有望作为膀胱癌治疗及诊断的有效靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14

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