细胞骨架成核剂Cordon-bleu对肾小管上皮细胞初级纤毛结构与功能的影响

发布时间：2018-02-10 20:20

本文关键词： ADPKD Cordon-bleu 细胞骨架初级纤毛　出处：《第二军医大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的:本研究主要验证常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)中是否存在细胞骨架蛋白成核剂cordon-bleu(Cobl)的表达异常,并探讨Cobl异常对初级纤毛结构和功能影响的可能机制,从而进一步了解和丰富初级纤毛致病假说,为临床上寻找多囊肾病新靶标提供理论依据。实验方法:1.常染色体显性多囊肾病中Cobl表达差异、初级纤毛结构和功能异常的生物学验证(1)运用Western blot及Real-time PCR方法检测人多囊肾囊肿衬里上皮细胞(WT9-12)与正常人肾小管上皮细胞(RCTEC)中、多囊肾病动物模型pkd1条件敲除小鼠(pkd1~(-/-))与正常对照小鼠(pkd~(1+/+))肾脏组织中Cobl的表达差异。(2)运用免疫组化方法观察WT9-12与RCTEC以及pkd1~(-/-)与pkd1~(+/+)肾脏组织中Cobl的定位变化情况。(3)利用激光共聚焦显微镜观察WT9-12与RCTEC中初级纤毛形态结构差异。(4)运用Real-time PCR方法检测WT9-12及RCTEC中KIF3A、IFT88的表达差异。2.细胞骨架紊乱对基体(basal body,BB)的迁移定位以及初级纤毛结构和功能的影响研究(1)采用免疫荧光方法观察WT9-12与RCTEC中、pkd1~(-/-)与pkd1~(+/+)肾脏组织中F-actin形态结构差异。(2)通过免疫荧光染色方法观察经细胞松弛素B(cytochalasin B,CB)处理的RCTEC细胞中F-actin、初级纤毛的变化情况以及基体的定位。(3)利用扫描电镜观察经CB处理的RCTEC细胞形态及初级纤毛形态结构变化。3.Cobl异常对初级纤毛结构和功能的影响研究(1)运用Western blot及Real-time PCR方法检测转染质粒过表达Cobl的RCTEC中Cobl、Pacsin 2、KIF3A表达变化情况。(2)运用Western blot及Real-time PCR方法检测经si RNA干扰下调Cobl表达的RCTEC中Cobl、Pacsin 2、KIF3A表达变化情况。(3)利用激光共聚焦显微镜观察转染质粒过表达Cobl及si RNA干扰下调Cobl的RCTEC中F-actin、基体及初级纤毛形态结构变化情况。(4)采用MTT法检测转染质粒过表达Cobl及si RNA干扰下调Cobl的RCTEC中细胞增殖变化情况。(5)采用流式细胞术检测转染质粒过表达Cobl及si RNA干扰下调Cobl的RCTEC中胞内钙离子浓度变化。(6)通过划痕实验观察质粒过表达Cobl及si RNA干扰下调Cobl的RCTEC中细胞迁移变化。结果:1.常染色体显性多囊肾病中Cobl表达差异、初级纤毛的结构和功能异常的生物学验证(1)运用Western blot及Real-time PCR方法检测发现WT9-12中Cobl表达较RCTEC明显增多;pkd1~(-/-)小鼠肾脏组织中亦得到相同结果。(2)通过免疫组化方法观察发现在RCTEC中Cobl主要定位于细胞核,而WT9-12的细胞核及细胞质中均有Cobl分布;pkd1~(-/-)及pkd1~(+/+)小鼠肾脏组织中Cobl主要于肾小管上皮细胞胞浆中,并且在pkd1~(-/-)靠近管腔侧异常增多。(3)利用激光共聚焦观察发现WT9-12中初级纤毛数量较RCTEC少,纤毛长度明显变短甚至消失。(4)运用Real-time PCR方法检测发现WT9-12中KIFA3及IFT88表达较RCTEC明显减少;pkd1~(-/-)小鼠肾脏组织中亦得到相同结果。2.细胞骨架紊乱对基体(basal body,BB)的迁移、定位以及初级纤毛结构和功能的影响研究(1)免疫荧光发现WT9-12胞浆中F-actin解聚变短,F-actin小体增多,呈现骨架弥散状态,而RCTEC胞浆中F-actin聚合形成粗大的F-actin束贯通于细胞内;与pkd1~(+/+)小鼠相比,pkd1~(-/-)小鼠肾脏组织中F-actin在肾小管上皮细胞胞浆靠近管腔侧异常沉积。(2)激光共聚焦观察发现经CB处理RCTEC 0h、1h、2h、6h后,胞浆中F-actin随处理时间延长解聚增加,初级纤毛长度变短甚至消失。(3)扫描电镜观察发现经CB处理后,RCTEC中初级纤毛随干扰时间延长长度变短甚至消失,细胞缩小。3.Cobl异常对初级纤毛结构和功能的影响研究(1)Western blot及Real-time PCR方法检测发现RCTEC转染质粒过表达Cobl后KIF3A表达下调;RCTEC经si RNA干扰下调Cobl后KIF3A表达增多。(2)激光共聚焦发现RCTEC转染质粒过表达Cobl后F-actin聚合增加,初级纤毛长度变长;RCTEC经si RNA干扰下调Cobl后F-actin解聚增加,F-actin含量减少,基体迁移障碍,初级纤毛长度变短甚至消失。(3)MTT法检测发现RCTEC转染质粒过表达Cobl后抑制细胞增殖,RCTEC经si RNA干扰下调Cobl后促进细胞增殖。(4)流式细胞术检测发现RCTEC转染质粒过表达Cobl后细胞内钙离子浓度明显增加,RCTEC经si RNA干扰下调Cobl后细胞内钙离子浓度减少。(5)细胞划痕实验观察发现RCTEC转染质粒过表达Cobl后细胞迁移增加、方向一致;RCTEC经si RNA干扰下调Cobl后细胞迁移能力减弱、方向紊乱。结论:本研究结果显示,人多囊肾囊肿衬里上皮细胞及多囊肾病小鼠模型中均存在细胞骨架蛋白成核剂Cobl表达上调,以及初级纤毛结构和功能异常。Cobl异常可影响F-actin的聚合作用,导致细胞骨架结构紊乱,从而抑制基体正常迁移至细胞膜顶端,最终导致初级纤毛长度变短。上调Cobl表达能改善F-actin聚合作用,促进基体迁移至细胞膜顶端,使初级纤毛长度增加、调节细胞内钙离子浓度、抑制细胞增殖状态、改善细胞迁移;下调Cobl表达抑制F-actin聚合作用,影响基体的正常迁移和定位,使初级纤毛长度变短、细胞内钙离子浓度减少、细胞增殖活跃、迁移紊乱。而前期发现的Cobl表达增加的差异性可能是由于PC1缺失无法形成有效的PC1-Cobl复合物而发挥一系列调控功能导致。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

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