顺铂诱导人肾小管细胞凋亡过程中microRNA表达谱筛选及HIPK2对该凋亡的影响

发布时间：2018-02-20 03:14

本文关键词： HKC 凋亡HIPK2 HKC 凋亡顺铂HKC细胞 microRNA 芯片生物信息学　出处：《北京协和医学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分建立顺铂诱导的人肾小管上皮细胞(HKC细胞)凋亡模型目的建立顺铂诱导的HKC细胞凋亡模型,选定下一步实验合适的顺铂浓度。方法向对数增长期的HKC细胞加入顺铂使其在培养液浓度分别为2、10和50μM,对照组为同样条件培养不加药组。检测HKC细胞存活率及凋亡率。结果HKC细胞存活率随顺铂浓度升高下降,凋亡率随顺铂浓度升高而升高。结论成功建立顺铂诱导的HKC细胞凋亡模型;并将10 μM顺铂确定为下一步实验所需浓度。第二部分顺铂诱导HKC细胞凋亡中microRNA表达谱及生物信息学分析目的筛查顺铂诱导HKC细胞凋亡的microRNA差异表达谱及mRNA差异谱,结合生物信息学方法筛选靶基因及构建Pathway-network,miRNAs-GO-network和miRNAs-Gene-network。进一步确定在顺铂诱导HKC细胞凋亡中发挥重要作用的 microRNA。方法利用Affymetrix Gene Chip miRNA芯片进行差异表达microRNA的筛选,分析获得microRNA差异表达谱;同时利用Affymetrix U133基因表达芯片筛选差异表达mRNA。microRNA 靶基因数据库筛选差异microRNA靶基因,联合基因表达芯片结果进一步确定microRNA靶基因。生物信息学分析推测差异表达的microRNA可能具有的生物学功能及参与的机制通路,然后基于microRNA对靶基因的负向性调控,构建 Pathway-network,miRNAs-GO-network 和miRNAs-Gene-network。根据以上网络,确定在顺铂诱导HKC细胞凋亡中发挥重要作用的miRNAs。结果差异表达的miRNAs聚类分析图结果显示各组组内的样本一致性较好。与对照组相比,实验组microRNA表达差异显著(p0.05),共筛选出差异性表达的microRNA47条;AffymetrixU133基因芯片筛选出差异表达基因共3831条。利用microRNA靶基因数据库筛选出差异microRNA的靶基因4760个,与基因芯片结果取交集后最终得到靶基因1181个,如ARHGEF4和BNC2等。进一步通过生物信息学方法得到分析网络:Pathway-network,miRNAs-GO-network和miRNAs-Gene-network,对network进一步分析得出可能在顺铂诱导的HKC细胞凋亡发挥重要作用的microRNAs,如miR-9-3p和miR-371b-5p。结论经顺铂诱导的HKC细胞microRNA表达谱与对照组相比有明显差异;miR-9-3p,miR-371b-5p可能在顺铂诱导的HKC细胞凋亡中发挥作用。第三部分HIPK2对顺铂诱导的HKC细胞凋亡的影响目的探讨HIPK2对顺铂诱导的HKC细胞凋亡的影响。方法首先构建顺铂诱导的HKC细胞凋亡模型,实时荧光定量PCR和Western blot检测HIPK2在不同浓度顺铂诱导的HKC细胞凋亡过程中的表达。其次,设计合成两条HIPK2siRNA干扰片段,通过脂质体转染HKC细胞,建立HIPK2干扰的细胞株,实时荧光定量PCR和Western blot方法分别检测HIPK2 mRNA和蛋白的表达,再用顺铂处理细胞,AnnexinV/PI检测细胞凋亡情况。最后,Western blot检测干扰HIPK2对凋亡相关蛋白bax表达的影响。结果顺铂诱导的HKC细胞凋亡过程中HIPK2 mRNA和蛋白表达水平均明显下调(p0.05),且随着顺铂浓度增高HIPK2表达逐渐降低。转染小干扰RNA后可显著降低HIPK2在HKC细胞内mRNA和蛋白的表达,且HIPK2表达降低后会促进顺铂诱导的HKC细胞凋亡。结论HIPK2可抑制顺铂诱导的HKC细胞凋亡。
[Abstract]:In the first part , the apoptosis model of human renal tubular epithelial cells ( HKC cells ) induced by cisplatin was established to establish a cisplatin - induced apoptosis model of HKC cells .

【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692

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