miR-26及其靶基因HMGA1对膀胱癌的影响

发布时间：2018-02-21 14:28

本文关键词： 膀胱癌 mi R-26 HMGA1:q RT-PCR　出处：《第三军医大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:膀胱癌的发病率在泌尿系恶性肿瘤中排第二位,其发病率和病死率在世界范围内逐年上升。中国人中膀胱癌是目前男性中发病率第8位,女性中第12位的高发恶性肿瘤,在泌尿生殖系统中位居首位;但是即使目前,我们尚未找到合适的标志物分子,对分析膀胱癌的发病机制、诊断、治疗提供帮助。膀胱癌的发生、发展是一个多因素复杂的过程,涉及多个基因、多个途径、多个环节的变化。micro RNA是一种小分子非编码、单链RNA,长度约18-25核苷酸,是最近研究较多的标的,可以在转录后调控基因的表达;研究发现,在包括膀胱癌在内的多数肿瘤存在特异性上调和/或下调的micro RNAs,它们一般都有自己特异性的靶基因,通过靶基因调控目标蛋白的表达来实现功能,在相对应的肿瘤细胞的调控中发挥相应的作用,。目的:本研究实时定量检测验证了膀胱癌组织和对应的癌旁组织中mi R-26及其可能的靶基因HMGA1的表达情况,对所预测的mi R-26的作用靶点基因HMGA1进行了验证,并在膀胱癌细胞系T24中通过获得性功能实验鉴定mi R-26的生物学功能。方法:1.获取126组配对的人膀胱癌切除术后标本,q RT-PCR检测mi R-26和HMGA1(可能的靶基因)的表达,统计mi R-26和可能的靶基因HMGA1在膀胱癌及癌旁非肿瘤组织中的表达量差异,以及miR-26和可能的靶基因HMGA1与不同膀胱癌样本的组织形态、临床分期、病理分期及分级之间的关系;利用在线数据库预测mi R-26和可能的靶基因HMGA1的关系,应用RNAi等技术干预后,验证靶蛋白表达量的变化(蛋白质印迹法等),检测mi R-26对下游靶序列的作用并进行鉴定(双荧光素酶报告系统)。通过膀胱癌细胞株T24体外转染mi R-26 mimic,以CCK-8、裸鼠成瘤等方法来进行获得性功能实验,分析mi R-26过表达对膀胱癌细胞T24的增殖、侵袭、周期的影响。结果:1.q RT-PCR检测126例肿瘤组织标本中,28例(22.22%)病例同时高表达的mi R-26和HMGA1 mRNA,30例(23.81%)例同时低表达miR-26和HMGA1 mRNA,28例(22.22%)mi R-26高表达而HMGA1低表达,40例(31.75%)例mi R-26低表达而HMGA1高表达。Spearman’s相关分析结果,膀胱癌组织中mi R-26的表达水平与hmga1mrna表达水平显著负相关(r=-0.72,p0.001)。2.在高病理分期、分级和阳性淋巴结转移的膀胱癌组织中mir-26的表达水平均显著低于病理分期早期(p=0.01),低病理级别的肿瘤(p=0.006),阴性淋巴结转移(p=0.02)。同时,hmga1的表达水平在高病理分期、分级,复发和阳性淋巴结转移的膀胱癌标本中均显著高于早期病理分期(p=0.01),低级别肿瘤(p=0.006)和无复发(p=0.02)。此外,同时有mir-26表达下调和hmga1表达上调的在高病理分期和高肿瘤级别标本中差异显著(两者均p0.001)。3.mir-26和hmga1的表达量与无瘤生存期及总生存期显著相关(四者均p0.001,log-rank检验)。不同mir-26a/hmga1表达量组合两两比较的结果表明,mir-26-low/hmga1-high组患者的无病生存期和总生存期之间和其他3组存在显著性差异(3者均p0.001)。mir-26-low/hmga1-high组的预后最差。4.利用在线算法进行了生物信息学分析。发现hmga13’-utr的mrna包含一个mir-26a互补的结合位点,序列比对分析提示hmga1可能是mir-26a调控膀胱癌的靶基因。5.应用特异性的rnai技术通过“减和增”功能来评估mir-26a介导hmga1对肿瘤抑制效应。定量qrt-pcr和westernblot实验表明沉默hmga1功能导致肿瘤细胞周期阻滞和细胞活性的下降,部分强制表达hmga1,很显著减弱mir-26a的g1期阻滞作用,hmga1是mir-26a介导的对膀胱肿瘤抑制功能的关键调控因子。6.将包含mir-26a可能的结合位点的144个碱基序列的3’-utrhmga1,插入双荧光素酶报告系统的的下游。转染wt+mir-26的肿瘤细胞,与其他组比较其荧光素酶活性显著降低。同时,转染突变型3’-utr的荧光素酶活动不受mir-26的影响,我们推断hmga1是mir-26的直接靶点。7.通过转染mir-26mimic在t24细胞过表达mir-26;mir-26过表达抑制肿瘤细胞的生长;流式细胞周期检测提示经过处理的t24细胞发生g1期阻滞;mir-26过表达同时可以抑制肿瘤细胞克隆形成和裸鼠体内成瘤能力;经转染处理的膀胱癌细胞t24,划痕实验、transwell小室实验提示其侵袭和迁移下降。结论:1.与癌旁非肿瘤组织相比,mir-26的相对表达量在癌组织中显著下调,而hmga1的相对表达量则显著上调。2.mir-26低表达和hmga1高表达与膀胱癌与病理分期、分级、转移、预后显著相关;同时mir-26低表达并hmga1高表达的预后最差。3.HMGA1是miR-26调控肿瘤生长的关键性蛋白,HMGA1是新确认的mi R-26的标靶。4.mi R-26在T24细胞中表达上调可诱导肿瘤细胞出现G1期阻滞和细胞增殖抑制。同时T24细胞的克隆形成和侵袭能力减弱。
[Abstract]:Background : The incidence of bladder cancer is the second place in the malignant tumor of the urinary system . The incidence and mortality of bladder cancer are increasing year by year in the world . However , even if we haven ' t found suitable marker molecules at present , it is a multi - factor complex process . It is a small molecule non - coding , single - stranded RNA with a length of about 18 - 25 nucleotides . It is a small molecule non - coding , single - stranded RNA . It has a length of about 18 - 25 nucleotides . It is a small molecule non - coding , single - stranded RNA . It can regulate gene expression after transcription . Objective : To investigate the expression of mi R - 26 and its possible target gene in bladder cancer cell line 24 by means of real - time quantitative detection of mi R - 26 and its possible target gene . log - rank test ) . The expression of mir - 26 was significantly lower than that in other groups .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.14

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