血管生成相关基因遗传变异与肾癌发

发布时间：2018-02-26 00:36

本文关键词： 血管生成肾细胞癌多态性易感性 VEGF VHL/HIF1A 预后索拉非尼疗效毒性　出处：《南京医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肾细胞癌(Renal cell carcinoma, RCC)简称肾癌,是全球常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,占肾脏占位性病变的80%-90%,在全球所有肿瘤新发病例中占3%左右,每年大约有10万患者死于肾癌。我国每年每十万人中大概有37.7个男性和16.6个女性确诊为肾癌,而欧洲人群和北美人群的发病率更高,男性发病率明显高于女性。目前,肾癌的全球发病率正以平均每年25%的速度增加,大约20%-30%的患者在确诊时肿瘤已发生远处转移而不能接受根治手术。肾癌日益增长的发病率和死亡率不仅给患者带来严重的健康损害,也给家庭、社会带来严重的经济负担。由于肾癌的病因和发病机制目前尚未明确,而治疗方面肾癌对放化疗均不敏感,分子靶向治疗的疗效亦存在较大的个体差异性,因此寻找各种生物学靶标以指导肾癌的早期诊断和个体化治疗的研究具有重要的意义。肾癌的形成是一个多因素和多阶段的过程,是环境危险因素和遗传因素共同作用的结果。目前有研究显示肾癌的发病与遗传、吸烟、肥胖、高血压等因素有关。然而,在具有或接触相同危险因素的人群中,却最终仅有少数人罹患肾癌,这显示了个体对肾癌的易感性(Suseceptibility)存在着差异。随着人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)的完成,已确认人类基因存在的遗传变异(Genetic variation)可以对基因的结构和功能产生影响,进而导致基因生物学功能的改变。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)是遗传变异中最常见的一种类型。在疾病的遗传易感性研究中,SNPs已被广泛用作基因定位的分子标记,通过比较正常人和患病者的SNPs来定位和识别特定疾病的相关基因。SNPs能够通过改变基因结构影响修复酶的功能,进而导致肿瘤发生的风险增加。目前研究发现血管生成与肿瘤的发生、发展密切相关,而肾癌组织中具有大量的新生血管,提示血管生成在肾癌的发病机制中发挥着重要的作用。我们的研究显示,血管生成相关基因的一些基因如VEGFA、VEGFR的功能性可通过调节其本身基因的表达而与肾癌发生的风险相关,而另一些基因如VHL、HIF1A的多个SNPs可能联合影响肾癌的进展和患者的生存。本研究为进一步揭示肾癌发生发展的生物学机制提供一定的理论依据,并通过寻找肾癌易感性生物标志物,为今后肾癌的高危易感人群筛查以及实施个体化预防、干预和治疗提供重要线索。第一部分血管生成通路基因VEGFA、VEGFR功能性多态与肾透明细胞癌易感性的关联性研究肾脏恶性肿瘤中大约85%-95%为透明细胞癌,而血管生成对于肾透明细胞癌的发生与发展至关重要。目前,尚缺乏血管生成相关基因的遗传变异与肾透明细胞癌发病风险的系统研究。本研究挑选并系统研究了与血管生成相关的7个主要基因,包括缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor-1α, HIF1A)、内皮PAS结构蛋白1(Endothelial PAS domain protein1, EPAS1,即HIF-2α)、血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A, VEGFA)、血管内皮生长因子受体1-3(Vascular endothelial growth factor receptor1-3, VEGFR1-3)和血小板衍生生长因子受体B(platelet-derived growth factor receptor beta polypeptide, PDGFRB),分析了24个潜在的功能性SNP位点,探讨血管生成相关基因的多态性与肾透明细胞癌发病风险的关系。本研究纳入859名肾透明细胞癌患者及1004名无癌患者,通过探针及Snapshot技术,针对筛选出的候选核苷酸多态性位点,运用logistic回归分析这些位点与肾透明细胞癌发病风险的关系。同时,通过实时定量PCR和荧光素酶报告基因检测相关SNP的生物学功能。结果发现,两个SNP位点(VEGFA rs2010963和VEGFR3rs448012)与肾透明细胞癌的发病率显著相关(rs2010963CC/GC vs. GG:P=0.048, OR=1.36,95%CI=1.12-1.66; rs448012CC/GC vs. GG:P=0.0448, OR=1.38,95%CI=1.13-1.69)。实时定量PCR显示rs2010963位点与VEGFA基因在肾癌中的表达上升相关,而rs448012位点并无差异。荧光素酶报告基因显示rs2010963位点的C等位基因较G等位基因更能增加荧光素酶的活性。上述结果提示,VEGFA的rs2010963位点与VEGFR3的rs448012位点与肾癌发病风险相关,且rs2010963可作为功能SNP位点通过调节内源性VEGFA基因表达影响肾透明细胞癌易感性。第二部分VHL/HIF1A基因多态与肾癌易感性及生存的相关研究缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor, HIF)作为转录因子能调控与血管生成、肿瘤细胞增殖、存活、扩散、凋亡等诸多基因的表达,因而HIF的过度表达可以激活包括VEGF基因,PDGF基因,趋化因子受体(Chemokine receptor, CXCR)基因,转化生长因子(Transforming growth factor, TGF-α)基因,表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)基因,可能是影响肾癌的发生、发展的重要因素。HIF的降解依赖于VHL蛋白(pVHL)。 VHL蛋白由抑癌基因VHL (von Hippel-Lindau, VHL)编码,该基因的突变、缺失等导致其表达或者活性的异常将影响HIF-1α的降解。这些基因的异常表达与肾癌的发生以后及预后密切相关。本研究探讨了肿瘤抑制基因VHL以及HIF1A基因多态对肾癌易感性以及患者生存的影响。本研究选取位于VHL和HIF1A基因功能区的SNPs,包括位于VHL基因启动子区的rs779805,位于HIF1A外显子的rs11549465, rs11549467和位于3’非编码区(3'-Untranslated Region)的rs2057482。采用Taqman-MGB分型方法对选取的SNPs分型。结果发现,这四个SNP位点的基因型在肾癌患者和正常对照人群中的分布没有明显的差异,并且对肾癌患者的生存率也没有显著的影响。但是通过联合分析,我们发现病例组中携带大于2个突变等位基因的患者发生淋巴转移以及肿瘤高临床分期明显低于不携带突变等位基因的患者(淋巴结转移P=0.032,临床分期P=0.041)。此外携带突变等位基因型患者的生存率较不携带突变等位基因型的患者显著增高,且随着携带突变等位基因的数目增多而呈剂量-效应反应关系(P趋势=0.013)。Cox回归分析发现携带突变等位基因是一个独立的影响患者生存的因素(P=0.025)。 VHL/HIF1A基因多态可以通过联合作用影响肾癌的进展和预后。鉴于VHL/HIF1A/VEGF通路在血管生成以及肾癌发生、发展中的重要作用,此生物通路上的多态对于分子靶向药物疗效的影响,将有助于更准确的预测肾癌患者的预后,并为晚期肾癌的分子靶向治疗提供指导。第三部分血管生成相关基因及药物代谢酶基因多态与索拉非尼治疗晚期肾癌患者的疗效及毒性研究索拉菲尼是一种新的口服靶向抗肿瘤药物,2005年12月被美国FDA批准用于治疗转移性肾细胞癌,也是最早进入中国临床应用于晚期肾癌患者治疗的分子靶向药物。索拉菲尼通过两种途径联合抑制肿瘤生长：(1)抑制Kit和Flt-3受体酪氨酸酶活性,在下游作为Raf丝氨酸／苏氨酸激酶抑制剂,抑制EGF介导的Ras/Raf/Erk/MEK信号传导通路,从而抑制肿瘤细胞增值,达到抑制肿瘤生长的目的；(2)抑制VEGFR和PDGFR的功能,抑制新生血管形成。本研究针对血管生成相关基因及药物代谢酶基因多态性与晚期肾癌患者接受索拉菲尼靶向治疗的疗效及毒性作用进行研究。本研究中100例晚期肾细胞癌患者均经过病理证实,其中男性患者63例,女性患者37例,收集相关临床资料。共选取了位于VEGF、VEGFR1,VEGFR2, VEGFR3、PDGFRA、PDGFRB、IL8、CYP3A4、CYP3A5、CYP1A1、CYP1A2、 ABCB1、ABCB2、HIF1A、EPAS1等基因功能区共计42个有潜在功能的SNPs进行研究。根据SNPs的特点,共采用了三种分型方法对其分型,包括聚合酶链反应和限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法、SNaPshot分型方法、PCR测序法碱基序列分析方法。整个研究的100例患者的中位无进展生存期(PFS)为31.8个月、中位整体生存期(OS)为46.7个月。结果发现,位于VEGF基因5’侧翼区的rs1570360和位于VEGFR2基因5’侧翼区的rs2239702与肾癌患者PFS明显相关,携带A等位基因的患者PFS均明显低于G等于基因携带者。而其中rs2239702与肾癌患者的OS明显相关,A等位基因携带者的OS明显低于G等位基因携带者(Log-Rank P=0.041)。此外,VEGFA基因启动子区rs2010963与晚期肾癌患者索拉菲尼用药后出现手足皮肤反应的危险性密切相关(P=0.005),而ABCB1基因外显子区rs1045642与高血压的发生有关(P=0.028)。基因多态性对靶向药物治疗肿瘤可能存在一定的影响,VEGF、VEGFR2等基因的特定基因型可能在一定程度上可以更好地提高患者对药物的反应性,延长患者的PFS和OS,使患者获得更好的预后,而VEGFA、ABCB1基因的特定基因型可能降低患者使用分子靶向药物索拉非尼的一些毒副作用。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.11

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