NRF2抗氧化应激信号通路的活化在糖尿病肾病中的保护作用及其机制研究

发布时间：2018-02-28 07:02

  本文关键词： 糖尿病肾病 莱菔硫烷 肝细胞生长因子 Nrf2信号通路 大鼠系膜细胞 活性氧 氧化应激 糖原合成酶激酶-3β 8-nitro-cGMP Fyn　出处：《复旦大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：前言糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)严重和常见的慢性微血管并发症之一,也是导致终末期肾衰和DM病人死亡的主要原因之一。对其发病机制的探讨一直是肾病研究领域特别受关注的热点之一。2001年Brownlee等提出了高血糖导致DM各种并发症的共同机制学说：即多种与DN发生发展密切相关的因素或环节,如遗传易感性、糖脂代谢紊乱、血流动力学异常和细胞因子、血管活性物质及化学趋化因子等过表达,都可能涉及一个重要的共同机制——氧化应激。过量的活性氧(Reactive Oxygen Specie, ROS)是高血糖激活多元醇、蛋白激酶C和己糖胺通路,以及形成晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products, AGEs)的重要环节。这使得人们对DN发病机制的认识有了突破性的进展。转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)是细胞防御氧化应激反应的重要转录因子,它可以与抗氧化反应元件(Antioxidant-Response Element, ARE)结合,上调抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达,增强细胞的抗氧化能力,因此Nrf2信号通路在细胞防御外源性或内源性的氧化应激过程中起重要作用。近年来研究发现,Nrf2信号通路对包括DN在内的多种以氧化应激为主要发病机制的疾病都具有保护作用。因此,Nrf2信号通路成为了DN保护性研究领域中的热点之一。肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)作为一种抗氧化剂对DN具有保护作用,但是其是否通过活化Nrf2信号通路发挥抗氧化作用及其相关的机制迄今为止尚无报道。生理情况下胞浆内的Nrf2与其胞浆抑制蛋白Kelch状ECH-相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein-1, Keap1)结合形成二聚体,经Keap1介导泛素化降解,活性处于抑制状态；氧化应激时Nrf2-Keap1二聚体解离,游离的Nrf2入核,与ARE结合上调抗氧化蛋白表达。最新研究发现,细胞内Nrf2信号通路的负性调控因子除了Keap1之外,还有糖原合成酶激酶-3β (Glycogen Synthase Kinase-3β, GSK-3β)。GSK-3β可以介导核内Nrf2的出核降解,从而负性调控Nrf2信号通路。莱菔硫烷(Sulforaphane, SFN)是一种Nrf2信号通路活化剂,在DN中,它可通过修饰Keap1来抑制Nrf2的降解,从而促进Nrf2入核,活化Nrf2信号通路。但是在DN中,SFN活化Nrf2信号通路过程中是否还可能涉及调节GSK-3p,来抑制Nrf2的出核?迄今为止国内外尚无报道。阐明这些有助于为DN的治疗研究提供新的理论线索。本课题建立体内、外DN模型,用R T-PCR、Western blot、流式细胞仪检测、免疫组织化学以及免疫荧光等实验方法,从体外角度观察了HGF对高糖(High Glucose, HG)刺激的大鼠系膜细胞内Nrf2信号通路的活化情况,并初步探讨这种作用所涉及的可能机制；从体内、体外观察了SFN对DN中Nrf2信号通路的活化情况,并探讨这种作用所涉及的可能机制,以期明确HGF、SFN对实验性DN模型抗氧化保护作用,为进一步认识DN发病机制以及临床治疗研究提供新的实验依据。第一部分高糖环境中HGF对大鼠系膜细胞抗氧化应激的作用及其机制研究目的 明确HGF是否通过活化Nrf2信号通路发挥对HG环境中大鼠系膜细胞(RatMesangial Cells, RMsC)抗氧化保护作用,并探讨相关机制。方法应用免疫荧光方法检测HGF对HG环境中RMsC 内 8-nitro-cGMP水平的影响；双氢一乙酰乙酸二氯荧光探针(DCFH-DA)捕获RMsC内ROS,应用流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞内ROS生成的情况；应用分光光度计法检测RMsC内谷胱甘肽(Glutathione, GSH)和丙二醛(Malonaldehyde, MDA) 的含量；应用分光光度计法检测细胞内一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase, NOS)的活性和一氧化氮(Nitric Oxide, NO)的含量；qRT-PCR和Westernblot的方法检测HGF对HG环境中MsC内Nrf2、谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位(Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic subunit, GCLC) mRNA和蛋白水平。结果HGF明显上调HG环境中RMsC内8-nitro-cGM P的水平,这一作用可以被HGF抑制剂SU11274、NOS抑制剂L-NMMA和sGC抑制剂NS2028完全阻断；HGF抑制HG环境中RMsC内ROS、MDA水平的升高,GSH水平的降低,这一作用可以被SU11274完全阻断、被L-NMMA和NS2028部分阻断；HGF能够恢复HG环境中RMsC内NOS的活性和NO的水平,这一作用可以被SU11274、L-NMMA完全阻断；HGF能够增强HG环境中RMsC内GCLC的mRNA水平和蛋白表达,这一作用可以被SU11274完全阻断、被L-NMMA及NS2028部分阻断；HGF对HG环境中RMsC的胞浆和胞核内Nrf2蛋白水平都有上调作用,但对Nrf2的nRNA水平没有影响,这一作用可以被SU11274、L-NMMA和NS2028完全阻断。小结HGF可以通过活化HG环境中RMsC内Nrf2信号通路,上调ARE下游基因GCLC表达对RMsC发挥抗氧化保护作用；HGF对HG环境中RMsC的抗氧化保护作用一部分是通过上调8-nitro-cGMP的水平来活化Nrf2信号通路实现的。第二部分SFN对STZ诱导大鼠糖尿病肾病模型中抗氧化应激的保护作用及其机制的研究目的明确在链脲佐菌素(Streptozocin, SrZ)诱导的大鼠糖尿病肾病模型中,SFN是否通过活化Nrf2信号通路发挥抗氧化保护作用,并探讨相关活化机制。方法建立STZ糖尿病肾病大鼠模型,检测血糖、尿糖、尿肌酐、尿肌酐蛋白比；肾脏组织石蜡切片HE、PAS、Masson染色观察肾脏形态学改变；免疫组化检测组织内8-oxo-dG、转化生长因子β1 (Transforming Growth Factor-β1, TGF-β1、纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)、IV型胶原(Type IV collagen, Col IV)、Nrf2、血红素氧合酶1 (Heme Oxygenasel, HO1)、醌氧化还原酶1 (Quinine Qxidoreductase 1, NQO1)、Keap1、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser9)及Fyn的蛋白水平；qRT-PCR检测组织内TGF-p1、FN、ColⅣ、Nrf2、Nqo1、Ho1、GSK-3β、和Fyn的mRNA水平。结果与STZ组相比,STZ+SFN组大鼠尿肌酐、尿蛋白肌酐比值明显降低,系膜区细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)沉积减少,肾小球纤维化程度和硬化指数明显减轻,8-oxo-dG 水平显著降低,TGF-β1、FN、ColⅣ的mRNA和蛋白表达明显降低,Nrf2及其下游基因Nqo1和Ho1的蛋白表达增强,但Nrf2的mRNA水平未见有改变,Nqo1和Ho1的mRNA则有上升,Keap1的蛋白和mRNA表达都没有差异；与Control组相比,STZ组大鼠肾脏内的GSK-3β、Fyn的蛋白水平明显升高,但两者的mRNA水平未见有显著变化；SFN升高STZ糖尿病大鼠肾脏内GSK-3p的活性抑制位点(Ser9)磷酸化水平,对GSK-3β和Fyn的aRNA和蛋白表达没有明显影响。小结SFN可降低8-oxo-dG和TGF-β1的水平及ECM的沉积,对STZ糖尿病大鼠肾脏具有抗氧化保护作用；SFN可活化STZ糖尿病大鼠肾脏内Nrf2信号通路；SFN可通过上调GSK-3β活性抑制位点(Ser9)的磷酸化水平来抑制STZ糖尿病大鼠肾脏内GSK-3β/Fyn信号通路。第三部分SFN对高糖刺激大鼠系膜细胞的保护作用及其机制的研究目的 明确SFN是否通过活化HG刺激的RMsC内Nrf2信号通路发挥抗氧化保护作用,并探讨相关的活化机制。方法用质粒转染方法建立瞬转GSK-3β高表达RMsC；用双氢一乙酰乙酸二氯荧光探针(DCFH-DA)捕获RMsC内ROS荧光显微镜观察ROS生成的情况；Westemblot检测细胞内TGF-β1、FN、ColⅣ、Nrf2、Nqo1、Ho1、Keap1、GSK-3β、 p-GSK-3β(Ser9)及Fyn的蛋白水平；qRT-PCR检测细胞内TGF-β1.FN.Col IV. Nrf2、Nqo1、Ho1、GSK-3β和Fyn的mRNA水平。结果转染PcDNA3.0GSK-3β表达质粒24h后MsC内GSK-3β的mRNA水平和蛋白水平明显升高；与HG组相比,HG+SFN组RMsC内ROS水平明显降低,TGF-β1、FNCol Ⅳ的mRNA水平和蛋白水平明显降低,Nqo1、Ho1的mRNA和蛋白水平明显升高,Keap1的mRNA水平和蛋白水平没有明显变化,胞核内Nrf2的蛋白水平明显升高,胞浆内Nrf2的蛋白水平和Nrf2的mRNA没有明显变化；与NG组相比,HG组RMsC内GSK-3β蛋白水平明显升高,Fyn的胞浆蛋白水平明显下降,Fyn的胞核蛋白水平明显升高,GSK-3β口Fyn的mRNA水平没有明显变化；SFN上调HG中RMsC内GSK-3β活性抑制位点(Ser9)磷酸化水平,下调Fyn的胞核蛋白水平,上调Fyn的包浆蛋白水平；HG+SFN组相比,HG+SFN+GSK-3β组MsC内GSK-3β的 mRNA和蛋白水平明显升高,ROS水平明显升高,TGF-β1、FN口Co1 Ⅳ的mRNA水平和蛋白水平明显升高,Nqo1、Ho1的mRNA和蛋白水平明显降低,胞核内Nrf2的蛋白水平明显降低,胞核内Fyn的蛋白水平明显升高,胞浆内Fyn的蛋白水平明显降低,而Fyn的mRNA水平没有变化。GSK-3β的上述作用可以被其小分子抑制剂LiCL抑制。小结SFN可通过降低ROS水平,以及TGF-p1.FN.Col Ⅳ的mRNA水平和蛋白水平对HG环境中RMsC发挥抗氧化保护作用。SFN通过上调HG环境中RMsC内GSK-3β活性抑制位点(Ser9)的磷酸化水平,抑GSK-3β/Fyn信号通路,活化Nrf2信号通路。GSK-3β抑制Nrf2信号通路的活化过程涉及上调RMsC内Fyn胞核内蛋白水平。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R587.2;R692.9

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本文编号：1546256