长期的标志保留细胞在小鼠缺血再灌注肾脏损伤修复过程中的作用

发布时间：2018-02-28 22:09

本文关键词： 标记保留细胞肾脏干细胞肾脏祖细胞肾组织再生肾脏缺血再灌注损伤急性肾损伤　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景近年来,随着人类寿命的延长和现代生活节奏的改变使患有急、慢性肾脏病患者人数显著增加。肾脏疾病发展至终末期后预后极差,目前治疗只能依靠透析或肾脏移植来维持患者生命,但是,患者接受透析治疗后仍会有许多严重并发症,肾移植治疗也因供体短缺而不能有效开展；同时二者的医疗费用是非常昂贵的。美国卫生组织的数据表明：虽然慢性肾脏病和尿毒症患者总数只占医疗人群的9.8%,但他们的医疗费用却占美国医疗预算费用总额的27.6%；每例终末期肾脏病患者消耗医疗费用约6.18万美元/年(约41万元人民币/年),即使是未接受肾脏替代治疗的慢性肾脏病第4期患者也将消耗医疗费用约1.27万美元/年(约8万元人民币/年)。在我国,虽然这些费用低于美国,但对一个没有充分医疗保障的家庭来说难以承受,每年数百亿的医疗花费对国家、社会也是一个沉重的负担。基于目前肾脏疾病治疗方面的严峻形势,我们急需寻找新的有效的治疗方式。终末期肾脏病的重要特征体现在有功能的健存肾单位的显著减少,因此理想的治疗方法是使受损肾组织形成新的有功能的肾单位。成体肾脏组织再生已经在鱼类中得到证实,尽管这种现象在成年哺乳类动物中很少被观察到。然而,有趣的是,无论是在人类还是在动物中,成体肾脏在受到急性损伤后会立即促使大量肾脏组织细胞再生以恢复受损组织。因此,近年来越来越多的研究显示成体肾脏可能具有组织修复再生能力,如能进一步明确这些急性肾损伤后肾脏组织修复再生过程中的细胞和分子学基础,这将为肾脏疾病的治疗带来新的曙光。目前成体肾脏急性损伤之后参与肾脏自身修复的细胞来源尚不明了。其组织修复过程中是否有肾脏固有干细胞或多潜能的肾脏祖细胞参与、是否是已分化的健存的成体肾脏细胞具有再生潜力,现在还存在很大争议。2003年,Maeshima等人首先用标志保留细胞(label retaining cells, LRCs)的方法去寻找成体肾脏干细胞或祖细胞,并提出在成年大鼠肾脏中存在类似于肾脏祖细胞的肾小管细胞参与到成体肾脏再生修复过程中。随后一些基于应用标志保留细胞技术的研究相继报道,在成体肾脏乳头部、近端小管S3段、肾皮质与外髓质交界处存在肾脏成体干细胞或祖细胞,并参与到肾脏损伤修复过程中。但是,一些基于应用干细胞表面标志物(如CD133和CD24)的研究显示,人类成体肾脏的祖细胞可能位于鲍曼氏囊壁的尿极,并可以产生新的足细胞和肾小管细胞。另外,最近一些基于谱系示踪技术的研究认为,健存的小管上皮细胞参与到肾脏的损伤修复中,而不是一些肾脏特异性的干细胞或祖细胞参与其中。总之,迄今为止国内外对于成年哺乳类动物肾损伤后组织修复再生的细胞学基础没有统一结论,不同的研究技术得到的结论并不一致。在临床上缺血再灌注引起的肾损伤是引起急性肾损伤的一个主要原因之一。鼠科动物的肾脏缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injured kidney)是急性肾损伤的一个经典动物模型,也是目前世界上公认的研究肾脏损伤修机制的动物模型之一。根据上述背景,本研究通过在新生小鼠腹腔内注射5-溴脱氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)以示踪肾脏固有的长期的标志保留细胞,并通过在成年小鼠中构建肾脏缺血再灌注损伤模型,进一步探讨其在急性肾损伤修复中的作用,明确其是否是真正的成体肾脏干细胞或祖细胞壁龛(stem/progenitor cell niches),为肾脏损伤修复的细胞学来源提供理论基础。研究目的1.观察成年小鼠肾脏缺血再灌注损伤后是否具有一定的组织自身修复能力；2.明确成年小鼠肾脏是否存在其新生时标记的LRCs及其分布位置和特征；3.探讨肾脏固有的长期标记的LRCs是否参与急性肾脏损伤后肾脏自身修复过程及其作用；明确其是否可以被认为是真正的成体肾脏干细胞或祖细胞壁龛。研究方法1.长期BrdU标记小鼠的模型构建。为标记长期的肾脏固有LRCs,我们在出生后12小时的新生C57BL/6J小鼠腹腔内注射BrdU (50μg/g),每天2次,连续注射3天。此后,这些新生小鼠在没有任何医疗操作的情况下生长至8周龄。2.成年小鼠肾脏缺血再灌注的模型构建。我们选取在新生已标记BrdU的8周龄雄性C57BL/6J小鼠,并随机分为以下各组：假手术组(n=30),肾脏缺血再灌注组(n=40)。实验处理如下：小鼠使用水合氯醛麻醉后,打开动物腹腔,使用无创性的微血管夹夹闭双侧肾血管22分钟,然后去除微血管夹,观察肾脏再灌注情况,关腹后注射预温37。C生理盐水lml以补充手术过程中体液的丢失。假手术组动物行开腹手术后,游离双侧肾蒂组织,但不进行肾血管夹闭,随后关腹。整个手术操作过程中,小鼠身体保持在一个37。C恒温电热毯上。分别于手术后Id、2d、3d、4d、5d、6d、9d、14d、28d处死小鼠,采集血液及心肝肾脏组织。3.肾脏功能评估。处死小鼠前留取血液标本,利用临床生化室仪器检测血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。4.肾脏病理检测。肾脏组织采用常规HE染色,通过显微镜观察小鼠肾脏缺血再灌注术后成体肾脏损伤修复的组织形态学变化。肾脏组织采用免疫组织化学染色来计数定位LRCs。除利用常规的免疫组织化学染色技术定位成体小鼠肾脏BrdU标记的LRCs外,为了更准确清晰的计数BrdU标记,实验中部分免疫组织化学染色标本未进行常规的苏木素细胞核染色。每张病理标本在200倍显微镜下随机选取5个视野,计数视野中BrdU阳性细胞核数,取其平均值计量为BrdU阳性细胞数量。5.双色免疫荧光检测。采用肾脏组织冰冻切片进行免疫荧光检测,使用荧光显微镜观察并摄影罗丹明、FITC标记的荧光二抗,从而间接检测肾脏组织中BrdU及Ki-67、BrdU及TUNEL、BrdU及LAT的表达。DAPI用于标记肾脏组织细胞核位置。6.统计学处理。服从正态分布的实验数据采用均数±标准差(x±s)的方式表示,使用统计软件SPSS 16.0处理,采用单因素方差分析进行组间均数的比较,P0.05被认为具有统计学意义。研究结果1.成年小鼠肾脏缺血再灌注损伤后肾组织恢复情况1.1肾脏功能恢复情况与假手术组相比,肾脏缺血再灌注组小鼠Scr、BUN在术后1天内显著升高,于术后24小时达到高峰。与术后基线相比,Scr值在术后24小时末约升高9倍(24小时末Scr vs术后基线Scr175.93±36.61 umol/1 vs 19.53±5.03 umol/1, p 0.05),此后Scr值逐渐降低,到术后第9天恢复正常水平。BUN值变化趋势基本与Scr值一致。1.2肾脏组织形态学恢复情况为了更直观的反应肾脏缺血再灌注损伤后组织修复再生情况,我们进行了肾脏病理HE染色。病理切片显示术后24小时小鼠肾脏组织可以观察到典型的肾小管损伤,这些典型的损伤在术后第3天仍然可以观察到,分布在肾脏组织的皮质、髓质,甚至肾乳头部。但是,在术后第4天,病理切片上可以明显地观察到新生小管细胞大量增殖,这些新生的聚集细胞趋向于形成一种特殊的类似于细胞壁龛样(the special niches-like structure)的结构。在接来下的3-5天内,肾脏组织结构快速恢复,肾小管扩张、小管上皮细胞崩溃脱落、管腔内刷状缘消失、管腔基底膜裸露等典型肾小管损伤明显减少。术后第9天,肾脏皮髓质及乳头部结构开始趋向正常。2.成年小鼠肾脏长期标记的LRCs分布2.1成年小鼠长期标记的LRCs分布位置及形态新生小鼠体内标记BrdU 8周后,成年小鼠肾脏内可以观察到零散分布的BrdU+ LRCs。大多数的LRCs分布在肾小管细胞,少量的LRCs分布在肾组织间质,其中有一部分LRCs是成对出现的；这些成对出现的LRCs约占其总量的21.7±1.5%。另外,我们观察到在成年小鼠肾脏内长期标记的BrdU+ LRCs的细胞核形态学特征并不一致,其中一些表现出核碎裂和核溶解现象,约占LRCs总量的10.1±0.9%。2.2成鼠肾脏缺血再灌注损伤后长期标记的LRCs分布位置及计数与假手术组比较,被标记有BrdU的雄性8周龄肾脏缺血再灌注组的小鼠肾组织内BrdU+ LRCs的数量随肾功能恢复而逐渐减少。其中术后第4天LRCs的数量减少最为显著,在肾皮质、髓质及肾乳头部分别减少85±2%,81±5%及95±5%。在术后第28天,肾组织内BrdU+ LRCs很难被检测到。3.长期标记的LRCs中只有部分细胞积极参与到成鼠肾脏缺血再灌注损伤修复过程中术后第4天,肾脏缺血再灌注小鼠的肾组织内可见大量肾小管细胞增殖,同时损伤坏死的肾小管明显减少。在这个损伤修复阶段,我们用Ki-67抗体标记新增殖的细胞、用TUNEL抗体标记凋亡坏死细胞。肾脏病理冰冻切片免疫荧光显示Ki-67标记的新增殖的细胞形成一种类似于壁龛样的特殊结构,这一结果与肾脏病理HE染色观察结果一致。但是,并不是所有的BrdU+ LRC s都位于这个结构内,只有那些成对出现的LRCs才趋向于与Ki-67共表达。另外,免疫荧光结果显示部分零散分布的LRCs趋向于与TUNEL共表达。4.成鼠肾脏缺血再灌注损伤修复过程中长期标记的LRCs生物学特点为了进一步明确成鼠肾脏LRCs的分化特征,我们选取了近端肾小管分化成熟标记物LTA,以研究LRCs分化程度,并判断其是否真正具有肾脏干细胞或祖细胞性质。双色免疫荧光结果显示损伤早期及正常成鼠肾组织可观察到一些零散分布的BrdU+LRCs与成熟的近端小管标志物LTA共表达,然而有趣的是,那些成对分布的BrdU+LRCs并未与LTA共表达。研究结论1.本研究通过小鼠缺血再灌注模型证实成鼠急性肾损伤后具有自身修复再生能力,并发现损伤后大量新生的肾小管细胞趋向于聚集形成一种类似壁龛样的结构以促进受损肾组织结构恢复。2.本研究结果证实成年小鼠肾脏存在零散分布的少量长期标记的LRCs,其中只有部分LRCs积极参与到成年小鼠肾脏急性损伤修复过程中。这部分LRCs主要表现为在损伤后新增生的细胞中成对出现。3.本研究首次发现长期标记的LRCs细胞核形态呈现多样性,有的甚至表现出核碎裂和核溶解。在小鼠肾脏急性肾损伤修复的同一阶段其细胞表型也不一致。因此,我们认为成鼠肾脏中长期标记的LRCs不是单纯的一种细胞；并提示在应用其寻找定位肾脏固干细胞的研究中,其生物学特性的复杂性应该被充分重视。4.本研究显示在小鼠肾脏缺血再灌注损伤后,早期修复出现前,长期标记的LRCs有的已呈现终末分化状态,进一步证实并不是肾脏全部的LRCs都可以被认为是慢周期细胞来定位肾脏固有干细胞或是祖细胞壁龛。5.本研究认为只有那些在小鼠肾脏缺血再灌注损伤后新生细胞中成对出现的LRCs才有可能是真正的肾脏祖细胞壁龛。本研究发现的成体肾脏长期标记的LRCs呈现的出多重生物学特征,为今后进一步深入探讨成体肾脏损伤之后自身修复的细胞学基础提供了更完善的证据及实验思路。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

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