Toll样受体-9在足细胞损伤中的作用及其机制研究

发布时间：2018-03-03 20:32

  本文选题：线粒体DNA　切入点：TLR9　出处：《南京大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是细胞表面模式识别受体 (Pattern recognition receptor, PRR),参与识别病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP),介导免疫细胞的激活,在天然免疫中起着重要作用。TLR9是免疫细胞专门识别病毒和细菌中非甲基化DNA(CpG-DNA)的模式识别受体,从而参与天然免疫。研究还发现TLR9也可表达于非免疫细胞如心肌细胞和疾病状态下的足细胞。我们前期研究明确了TLR9参与嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside, PAN)诱导的足细胞凋亡,但尚未确定该模型中激活TLR9的配体。由于真核细胞线粒体起源于细菌,即由古细菌在真核细胞浆内通过共生作用(endosymbiogenesis)进化而来,而且线粒体DNA(mtDNA)保留了CpG基序未甲基化的特性,因此,我们推测足细胞内源mtDNA可能是TLR9的配体。本研究将验证如下研究假说：PAN诱导mtDNA向溶酶体的转移和积累,溶酶体内的TLR9以mtDNA为配体,激活NFkB和p38 MAPK通路,进而促进足细胞凋亡。方法：1.建立体外培养足细胞的PAN损伤(凋亡)模型,明确TLR9表达水平、NF-κ B p65磷酸化、p38 MAPK磷酸化、以及细胞因子IL-12等的上调。2.将脱氧核糖核酸酶2 (Dnase2)过表达质粒或干扰质粒转染进入足细胞,以免疫印迹确定PAN诱导的NF-κB p65和p38 MAPK磷酸化的变化、以qRT-PCR确定IL-12的变化,以流式细胞术确定足细胞凋亡变化。3.通过免疫荧光染色对mtDNA与溶酶体进行共定位,明确PAN是否诱导细胞内源mtDNA向溶酶体的转移,从而确定在PAN诱导的足细胞损伤模型中mtDNA是激活TLR9的配体。4.制备PAN诱导大鼠足细胞损伤模型,以免疫组化检测TLR9的表达、以qRT-PCR检测大鼠肾小球中线粒体DNA量的变化、以qRT-PCR检测肾小球凋亡标志物p53和Bax的表达,从而在活体水平验证我们的研究假说。结果：(1)PAN处理的人永生化足细胞中,TLR9 mRNA和蛋白水平显著上调、NF-κ B p65和p38的磷酸化水平显著上升、CD2AP表达显著下调、足细胞凋亡率显著升高,表明PAN诱导足细胞损伤建模成功。(2)CpG寡核苷酸(CpG ODN)能激活p38和p65,并激活NFκB荧光素酶报告基因的表达,证明足细胞内存在具有功能的TLR9信号通路。(3)PAN处理使Picogreen和Lysotracker的荧光共定位显著增加,由于Picogreen和Lysotracker分别显示mtDNA和溶酶体的位置,表明PAN促进mtDNA在溶酶体中聚集,同时,足细胞内mtDNA总量相应减少。(4)过表达Dnase2能减少PAN诱导的p38和p65磷酸化水平上调,并减轻PAN-诱导的细胞凋亡。(5)转染Dnase2干扰质粒能进一步提高PAN诱导的p38和p65磷酸化水平,并且Dnase2干扰自身足以诱导足细胞凋亡。(6)PAN大鼠模型中,足细胞TLR9表达显著上调,mtDNA含量显著下降,以及凋亡标志物p53和Bax显著上调,提示在活体状态下,TLR9能以mtDNA为配体诱导足细胞的凋亡。结论：足细胞内源mtDNA能作为TLR9的配体,通过激活TLR9信号通路,上调促凋亡的NFkB和p38 MAPK活性,从而参与PAN诱导的足细胞损伤。本研究提示mtDNA和TLR9可作为肾小球疾病的治疗靶点。
[Abstract]:Objective: Toll like receptors (Toll-like receptors, TLRs) are pattern recognition receptors of cell surface (Pattern recognition receptor, PRR), in recognition of pathogen associated molecular patterns (Pathogen associated molecular pattern, PAMP), mediated by activation of immune cells, plays an important role in innate immune.TLR9 is unmethylated DNA specific immune cells identification of viruses and bacteria (CpG-DNA) pattern recognition receptors, and thus participate in innate immunity. The study also found that TLR9 can also be expressed in non immune cells such as myocardial cells and the condition of the foot cells. Our previous study identified TLR9 in puromycin aminonucleoside (puromycin aminonucleoside, PAN) - induced apoptosis of podocytes, but has not yet been determined TLR9 ligand activation of the model. Because of the eukaryotic cell mitochondria originated in bacteria, namely Archaea in eukaryotic cells by symbiosis (end Osymbiogenesis) evolved, and mitochondrial DNA (mtDNA) retains the characteristics of unmethylated CpG motifs therefore, we speculate that podocyte may be endogenous mtDNA ligands of TLR9. This study will verify the following hypothesis: PAN induced mtDNA to lysosomal transfer and accumulation of lysosomes of TLR9 using mtDNA as ligand NFkB and p38, activation of MAPK pathway, thereby promoting podocyte apoptosis. Methods: 1. in vitro culture PAN cell injury model (apoptosis), clear expression of TLR9, NF- kappa B p65 phosphorylation, p38 phosphorylation of MAPK, upregulation of.2. and cytokine IL-12 will deoxyribonuclease 2 (Dnase2) expression the interference plasmid or plasmid were transfected into Sertoli cells by Western blot, determine the changes of PAN induced by NF- B and p38 p65 kappa MAPK phosphorylation, qRT-PCR to determine the changes of IL-12, flow cytometry was used to determine the change of podocyte apoptosis by immune.3. Co localization of mtDNA fluorescent staining and lysosomes, to determine whether PAN cells induced by endogenous mtDNA to lysosomal transfer, to determine the podocyte injury model induced by PAN in mtDNA is the activation of the TLR9 ligand.4. preparation model of podocyte injury in rats induced by PAN expression by immunohistochemical detection of TLR9, changes in qRT-PCR detection mitochondrial DNA in rat glomerular volume, glomerular apoptosis detected by qRT-PCR marker p53 expression and Bax, in order to verify our hypothesis in vivo. Results: (1) human immortalized podocytes in PAN treatment, TLR9 mRNA and protein levels increased significantly, significantly increased NF- kappa B and p38 p65 the level of phosphorylated CD2AP expression was significantly reduced, the rate of podocyte apoptosis was significantly increased, suggesting that PAN induced podocyte injury model. (2) CpG (CpG ODN) oligonucleotide can activate p38 and p65, and the activation of NF kappa B luciferase reporter base Because the expression of podocyte that memory in the TLR9 signaling pathway has the function. (3) PAN to Picogreen and Lysotracker fluorescence co localization of Picogreen and Lysotracker increased significantly, due to show mtDNA and lysosomal location, indicating that PAN promotes mtDNA in lysosomal accumulation, at the same time, podocyte total mtDNA decreased. (4) overexpression of Dnase2 can reduce the PAN induced p38 and p65 phosphorylation level increased, and reduce the cell apoptosis induced by PAN-. (5) Dnase2 interference plasmid can improve PAN induced p38 and p65 phosphorylation, and Dnase2 interference itself is sufficient to induce podocyte apoptosis. (6) PAN rats in the model, podocyte TLR9 expression increased significantly, mtDNA content decreased and apoptosis markers p53 and Bax were significantly up-regulated, suggesting that in vivo, TLR9 with mtDNA as ligand induced podocyte apoptosis. Conclusion: endogenous podocyte MtDNA can act as a ligand of TLR9, and activate the TLR9 signaling pathway to upregulate the activity of NFkB and p38 MAPK, which is involved in PAN induced podocyte injury. This study indicates mtDNA and TLR9 can be used as therapeutic targets for glomerular diseases.

【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692

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本文编号：1562620