XIAP抑制剂Embelin抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移的研究

发布时间：2018-03-06 20:21

本文选题：XIAP　切入点：Embelin　出处：《南方医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：世界范围内,膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,发病率居全身恶性肿瘤的第11位,其中男性排名第7位,女性排在第10位之后。2012年世界范围内新发膀胱癌例数为429800个,死亡病例为165100个。在我国,男性膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第7位,女性排在第10位之后。2009年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万,其中男、女性发病率分别为11.41/10万和3.51/10万。近些年来,我国膀胱癌的发病率呈逐年增高趋势。膀胱癌的发病特点为：1,膀胱癌的主要发病年龄在中年以后,并且发病率随年龄增长而增加。2,约70%-85%的膀胱癌为表浅性膀胱癌,又称为非肌层浸润性膀胱癌(non muscle invasive bladder cancer, NMIBC),包括Ta、T1和Tis期的膀胱癌。3,约10-30%的表浅性膀胱癌患者最终会发展成为肌层浸润性膀胱癌或者转移性膀胱癌。4,10%-15%的肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer,MIBC)包括T2-T4期的膀胱癌患者,在确诊时已发生转移,即使行根治性膀胱切除术后,高达50%的患者会出现转移或者进展。5,膀胱癌的组织学类型,以尿路上皮癌为主,约占90%以上,对化疗中度敏感。诊疗指南推荐的膀胱癌治疗方案的特点：表浅性膀胱癌,经尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral resection of bladder tumor, TURBT)+灌注化疗；T2-T4a,根治性膀胱切除术+盆腔淋巴结清扫+尿流改道,必要时新辅助化疗和(或)辅助化疗和或(放疗)；T4b,姑息的手术治疗+化疗和(或)放疗,其中我们发现化疗始终贯穿了膀胱癌的治疗。虽然近几年来膀胱癌的诊治水平不断提高,也出现了一些新方法如免疫治疗、分子靶向治疗、基因治疗、生物治疗、激光治疗及光动力学治疗等,但浅表性膀胱肿瘤的复发率仍然很高。尽管目前对浸润性尿路上皮癌进行了根治性膀胱切除术和(或)放化疗,但是进展期膀胱癌患者的预后较差,生存时间较短。膀胱癌治疗的难点是容易复发及易发生局部浸润和远处转移。所以,为了改善膀胱癌患者的总体生存率,提高生活质量,改善预后的关键是在于降低复发率,控制肿瘤的浸润及转移,必须在膀胱癌诊断、治疗方面,不断深入探讨,寻找新措施,探讨新途径,发现新机制,同时,这也是目前肿瘤领域一直关注、研究的重要问题。伴随着分子生物学以及基因工程技术突飞猛进的发展,研究人员也取得了很多可喜的成果,发现了有一些新的调控位点,调节蛋白以及其中的调节关系和信号通路等,进一步明确了膀胱癌的发病机理,调控机制,为制定更加先进的诊断方法,更加完善的治疗方案提供了新的靶点。细胞凋亡是由基因调控的自主性死亡方式,这种方式对于稳定多细胞生物机体具有重要意义,细胞凋亡机制的失衡与细胞的癌变联系密切,前者往往能够诱发后者的发生。近年来新发现的凋亡抑制蛋白IAPs (inhibitor of apoptosis protein)是高度保守的内源性抑制细胞凋亡的基因家族成员之一,对肿瘤的产生和发展具有重要的影响意义,可以起到内源性凋亡抑制作用。X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein, XIAP)是调亡抑制蛋白家族中最有效的caspase抑制剂之一,是唯一一个可与凋亡启动因子caspase-9和效应因子caspase-3, caspase-7结合的凋亡抑制蛋白,还可以通过多种信号通路途径参与抑制内源性或外源性凋亡诱导引起的细胞凋亡。所以,在caspase通路中,XIAP是唯一能够在起始阶段和效应阶段同时发挥抑制作用的IAPs。若其蛋白水平被检测在细胞中高度表达,往往提示肿瘤的发生。研究显示,很多恶性肿瘤细胞中,XIAP均呈过度高表达,而且,往往预示着患者的预后较差,XIAP目前被视为IAPs家族中潜在的肿瘤治疗靶点。Yang等研究发现凋亡抑制蛋白livin、survivin、XIAP同时表达于膀胱癌细胞,当同时敲掉这三个蛋白基因后,发现膀胱癌T24细胞的增殖和侵袭能力下降,并且细胞内caspase-3、caspase-7、caspase-9活性均显著增加,由此推断这三个基因能够成为膀胱癌治疗的重要多靶向基因。Embelin是一种中药提取物,最初发现其有抗感染、抗炎以及抗细胞增殖等作用。2004年Nikolovska-Coleska等通过计算机筛选发现Embelin能与XIAP的杆状病毒1AP重复序列3(Baculovirus lAP Repeat 3, BIR3)结构域caspase的第二个线粒体激活剂(Second mitochondrialactivator of caspases, Smac)结合位点相结合,是一种新型的XIAP小分子抑制剂。一些国内外研究人员已经应用Embelin对乳腺癌、胰腺癌、胃癌和白血病等肿瘤细胞进行了体内及体外研究试验,证实Embelin可以通过抑制XIAP而抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。胡荣等研究证实Embelin可以通过促进细胞凋亡逆转K562／D对DNR的耐药性,其抗肿瘤作用已经成为近些年重要课题的研究热点,然而,Embelin在膀胱癌是否有同样的抗肿瘤作用尚未见报道。目前寻找高效、低毒的天然药物作为抑制肿瘤侵袭转移的药物研发的热点,探讨肿瘤侵袭转移的机制是肿瘤学研究的重要方面。我们探讨开展XIAP抑制剂Embelin对膀胱癌细胞的增殖、迁移和凋亡的影响,并探讨可能的机制,为其应用于膀胱癌的化学治疗提供实验依据。研究目的：1.检测XIAP蛋白在膀胱癌组织和细胞中的表达,探讨高表达的XIAP在膀胱癌发生和发展中的意义,在加入不同剂量的Embelin后,用Western Blot法检测膀胱癌细胞中XIAP蛋白的表达水平变化,探讨Embelin对膀胱癌细胞中XIAP蛋白表达的抑制作用。2.通过采用不同浓度的Embelin对膀胱癌细胞T24和5637进行处理,然后用CCK8法检测在不同时刻膀胱癌细胞的增殖抑制情况,探讨Embelin对癌细胞增殖影响,并探讨其抑制机制。3.通过采用Trans well法检测Embelin对膀胱癌T24细胞的迁移率和侵袭率影响,探讨Embelin对癌细胞迁移和细胞侵袭的抑制作用。4.使用不同浓度的Embelin处理T24细胞和5637细胞,采用流式细胞仪法检测膀胱癌细胞的凋亡情况,并用Western Blot法检测膀胱癌细胞中的XIAP, PI3K, Akt和p-Akt蛋白表达,探讨Embelin促进膀胱癌细胞凋亡的可能凋亡机制。研究方法：1.细胞培养及药物干预：用含有10%新生胎牛血清的RPMI-1640培养液培养人膀胱癌细胞株T24和5637(所有培养液中都包含有青霉素100U/mL和100μg链霉素/mL),并置于温度为37℃,饱和湿度为5%CO2的孵箱中培养；当细胞达到对数生长期时将细胞铺板,使用Embelin浓度分别为5,20,35μmol/L干预,同时设立DMSO空白对照组,干预时间为12h,24h,48h。每组实验都重复3次以上。2.CCK-8法检测细胞存活率：取对数生长期的T24和5637细胞,消化后制成单细胞悬液,调整细胞浓度为5×103/ml,并接种于96孔板中,每孔体积为200μL,置于温度为37℃,饱和湿度为5%CO2的孵箱内培养过夜。加入不同浓度Embelin的处理(设5个不同浓度,即5,10,20,25,35μmol/L),同时设立空白对照组。每组设4个平行孔。分别于12h、24h、48h后取出96孔板,每孔加新的培养基100μL和CCK-8溶液10μL,37℃继续孵育4 h,各孔在BIO-RAD550酶联免疫检测仪上以450 nm波长(650 nm作为参考波长)测定吸光度A值,计算出细胞存活率及半数抑制浓度(IC50)按如下公式计算细胞存活率：存活率=实验组OD÷对照组OD×100%。3.流式细胞仪检测细胞凋亡：用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测膀胱癌T24和5637细胞的凋亡。收集实验处理后的细胞,经胰蛋白酶消化后PBS洗3次,1000rpm离心5 min,弃上清。用Annexin V-FITC缓冲液195μL重悬细胞后加入5μLAnnexin V-FITC混匀,在室温下送暗室里染色10 min后,1000rpm离心5 min。Annexin V-FITC缓冲液190μL重悬细胞后再加入10μL碘化丙啶混匀染色。冰上3 min终止反应,避光及时送流式细胞学检测。使用Cell Quest软件分析数据。每组实验都重复3次以上。4. Transwell法检测细胞迁移和侵袭：我们使用含有8.0μm膜孔的Transwell小室来检测肿瘤细胞的迁移能力。取指数生长期T24细胞加入不同浓度Embelin的处理(设3个不同浓度：即5,20,35培养24h后,加入无血清培养基继续培养24h,用无血清培养基重悬细胞,放入上室,每组设3个平行孔。用棉签擦掉未穿过膜的滤膜上层细胞,膜下细胞用95%酒精固定并用0.1%结晶紫染色。随机挑选5个不同视野的穿膜细胞数,并于200倍光学显微镜下拍照。每组实验都重复3次以上。5.免疫组织化学(IHC)染色法：所有标本均经10%甲醛固定24h。常规石蜡包埋,切成组织薄片(4gm)放置在硅烷涂层的载玻片上,经过常规脱蜡,逐级酒精入水,3%过氧化氢孵育15min, PBS冲洗3次,在121℃的柠檬酸盐缓冲液中孵育10min进行热抗原修复。室温下放置20min后,样本在室温下存放于封闭液中孵育15min,然后加入抗-XIAP抗体于4℃反应过夜,免疫组织化学(IHC)染色法采用标准的链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术。DAB显色剂显色,苏木素复染,中性树脂封片。阴性对照组不加入抗体。两个不清楚临床病理因素的病理专家分别评估最终结果。基于整个玻片给出最终的免疫染色的结果。结果的判定是通过评估整个载玻片上癌组织和癌旁组织的染色阳性百分比和染色的亮度来区分的。6.蛋白免疫印迹杂交(Western Blot Analysis):取对数生长期的T24细胞在药物干预前1天接种于6孔板中。细胞经Embelin干预48h后,收集细胞,利用RIPA细胞裂解液提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,并调整待测样本的蛋白质含量。样本在5倍SDS-PAGE上样缓冲溶液中溶解,旋转,然后放入100℃中5min变性,再放置冰上孵育5 min。每孔加细胞裂解液(相当于30μg的蛋白)电泳、转膜、室温下封闭1h,把膜放入含有一抗的的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水中(里面包含有5%脱脂牛TBST),置4℃冰箱温和振荡过夜。回收一抗后在TBST中洗膜30min,中间更换TBST3次,分别把膜置在室温下于稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗中温和振荡2h,后根据商业化ECL化学发光检测试剂盒的具体操作步骤曝光、显影及定影。蛋白条带的量化使用ImageJ 1.33软件,数据处理的内参为β-actin。7.统计学分析：所有的实验数据经SPSS 15.0统计软件进行分析,结果的输出采用均数±标准误。实验组间的统计学差异用卡方检验分析,两组之间的单一比较用T检验分析。检验水准P0.05差异具有统计学意义。研究结果：1.①Embelin能够抑制膀胱癌细胞中XIAP的表达,并且随着浓度的升高抑制作用越强：膀胱癌细胞在干预浓度分别为0、5μmol/L, 20μ mol/L, 35μmoVL Embelin的作用下,结果显示XIAP的杂交条带随着Embelin剂量的增加,信号逐渐变浅,提示癌细胞中的XIAP的表达量逐渐减少。②免疫组化结果提示XIAP主要表达于膀胱癌细胞的细胞质中,在膀胱癌旁组织的细胞中,XIAP的表达量显示较低或者阴性,而在膀胱癌细胞中,XIAP蛋白均显示高表达,差别具有统计学意义(P0.001)。当我们把膀胱癌组再细分为肌层浸润和非肌层浸润亚组比较时,结果显示肌层浸润亚组的IHC得分明显高于非肌层浸润亚组,差别具有统计学意义(P0.01)。2.①Embelin抑制T24细胞的增值结果：未经过Embelin处理过的T24细胞在培养24h、48h、72h时的抑制率基本为0：经过5.0μmol/L的Embelin处理后的T24细胞在培养24h、48h、72h时的平均抑制率分别为11.896%、12.664%、15.000%；经过10.0μmol/L的Embelin处理后的T24细胞在培养24h、48h、72h时的平均抑制率分别为24.401%、30.906%、38.698%；经过20.0μmol/L的Embelin处理后的T24细胞在培养24h、48h、72h时的平均抑制率为34.968%、43.941%、57.121%；经过25.0μtmol/L的Embelin处理后的T24细胞在培养24h、48h、72h时的平均抑制率为50.278%、55.322%、64.078%；经过30.0μmoVL的Embelin处理后T24细胞在培养24h、48h、72h时的平均抑制率为58.333%、79.333%、87.753%,差别具有统计学意义(P0.05)。②Embelin抑制5637细胞的增值结果：未经过Embelin处理的5637细胞在培养24h、48h、72h时检测到的抑制率为0；经过5.0μtmol/L的EmbelinEmbelin处理后的5637细胞在培养24h、48h、72h时的平均抑制率分别为8.667%、12.104%、43.333%；经过10.0μmol/L的Embelin处理后的5637细胞在培养24h、48h、72h时的平均抑制率分别31.075%、50.239%、56.000%；经过20.0μamo VL的Embelin处理后的5637细胞在培养24h、48h、72h时的平均抑制率为48.301%、72.333%、83.093%；经过25.0μmol/L的Embelin处理后的5637细胞在培养24h、48h、72h时的平均抑制率为62.632%、85.322%、94.078%；经过30.0μmoVL的Embelin处理后5637细胞在培养24h、48h、72h时的平均抑制率为65.333%、80.565%、96.832%,差别具有统计学意义(P0.05)。3.①Embelin抑制T24细胞的迁移能力：Transwell法检测结果的照片显示,未经Embelin处理的T24细胞的迁移较为明显,照片中蓝染部分较多,染色较深；经过Embelin (干预浓度分别为0、5μtmol/L、20μmol/L、35μmol/L)处理后的T24细胞,随着Embelin剂量的增大,照片的蓝染逐渐减弱,迁移的数量和范围逐渐减少,平均迁移的细胞数量分别为333.333,285.38,214.035,95.906,差别具有统计学意义(P0.05)。②Embelin抑制T24细胞的侵袭能力：未经Embelin处理的T24细胞侵袭能力较强,照片中蓝染浓密；Embelin对T24细胞的侵袭影响与迁移影响一致,均是随着Embelin干预浓度的增大,其抑制效果逐渐增强,平均侵袭的细胞数量分别为246.784,192.982,130.994,65.497,差别具有统计学意义(P0.05)。4.①Embelin促进膀胱癌细胞的凋亡：散点图结果显示,膀胱癌T24和5637细胞在干预浓度分别为0、5μmol/L、20μmol/L、35μmol/L Embelin的作用下,都出现细胞凋亡,且随着Embelin剂量的增加,右上和右下象限的散点逐渐增多,提示凋亡细胞的数量逐渐增加,T24和5637的凋亡率分别为3.849%,5.64%,12.067%,15.074%和4.621%,7.347%,11.152%,14.815%,差别具有统计学意义(P0.01)。②蛋白质印迹分析检测PI3K, Akt, XIAP和p-Akt蛋白结果显示,膀胱癌T24细胞在干预浓度分别为0、5μmol/L, 20μmol/L, 35μmoVL Embelin的作用下,细胞中的XIAP, PI3K,磷酸化Akt杂交条带信号逐渐变浅,提示癌细胞中的XIAP, PI3K,磷酸化Akt的表达水平显著下降,Akt蛋白没有显著变化,这说明Embelin可以促进膀胱癌细胞的凋亡,抑制XIAP蛋白的表达,推测可能是通过PI3K/Akt信号通路途径实现的。研究结论：1.XIAP在膀胱癌组织和细胞中呈高表达,并且主要分布在癌细胞的细胞质中,XIAP的过量表达与膀胱癌的临床分期可能有一定的关系。Embelin可以有效地抑制膀胱癌细胞中XIAP蛋白的表达,并在一定范围内,随着剂量增大,抑制效应增强。2. Embelin能抑制膀胱癌细胞的增殖,且抑制作用呈明显的剂量、时间依赖性,提示Embelin可能成为一种新的膀胱癌化疗药物。3. Embelin对膀胱癌细胞T24的迁移和侵袭能力均有明显的抑制作用,采用Embelin控制肿瘤细胞的扩散和转移,并用于改善患者的状况应具有很高的临床应用价值和良好的发展前景。4. Embelin能够促进膀胱癌细胞T24和5637的凋亡,抑制XIAP蛋白的表达,初步推测是通过PI3K/Akt信号通路途径实现的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14

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