前列腺癌相关基因TTTY15-USP9Y及mirna-182-5p功能机制的研究

发布时间：2018-03-14 08:33

本文选题：前列腺癌　切入点：融合基因　出处：《第二军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:前列腺癌是全世界发病率最高的男性恶性肿瘤,无论是在美国还是是在中国都是男性高发的疾病,并在近些年的中国患者中呈明显上升趋势。前列腺的研究存在两个显著的困境,一是有效地治疗靶点,在手术疗法、内分泌疗法、放化疗法和生物疗法等治疗手段不断发展的基础上,局限性前列腺癌的治愈率在不断提高,但总死亡率仍是居高不下,根源于治愈患者的复发并进展为激素抵抗的转移性前列腺癌。因此,研究前列腺癌浸润及转移的分子机制,发现新的前列腺癌的治疗靶点成为目前前列腺癌研究的重点。二是诊断的标志物,目前一系列的治疗手段均参考于血清PSA的水平。PSA检测的弊端在于假阳性,导致不必要的穿刺和治疗负担。很多年来,研究者们包括临床工作者致力于寻找更加特异的诊断方式,诊断标志物。包括近年兴起的有关前列腺癌的miRNA的研究,Lnc RNA的研究,PSA异构体的研究,PSA联合长联非编码RNA的共同诊断,血清环状RNA的研究,前列腺癌外泌体及外泌体相关miRNA,蛋白的研究,融合基因的研究。各个领域都力图寻找到优异的前列腺癌诊断标志物和治疗靶点。融合基因最早成名于血液病中的费城染色体,其开启了有关人肿瘤领域的融合基因的研究。该融合基因在血液肿瘤中具有良好的诊断效率,并为该型血液病的治疗提供了支持与指导。在此经典融合基因之后,各肿瘤领域相继展开了组织特异性融合基因的探索。有碍于当时科研技术水平的限制,融合基因难以被检测发现,伴随着不断的测序技术发展,肿瘤数据库的不断完善,一些基因的融合被探测出来。前列腺癌领域最早,最经典的融合基因是ETS家族相关的融合基因。该融合基因包含很多种亚型。到此时期,相关的已发现的融合基因,都是经典的DNA层面的融合。这种融合带来了优秀的诊断效率和预后指导。伴随着基因测序技术的逐步完善,发现了一些嵌合体RNA,相比较于DNA层面的融合,嵌合体RNA有更好的灵活性,更丰富的剪接方式,极大地扩充了有限的人类蛋白编码基因的范畴,使得人体能够在基因有限的情况下,拥有更丰富的编码蛋白或基因调控方式。而这个时期的嵌合体RNA几乎指的都是反式剪接,并且反式剪接最早并不是发现于人类基因组,经典的反式剪接首先在锥虫和线虫被发现,后期发现在人类身上。仅此一步,已为融合基因的丰富性打下了良好的基础。近年,有关嵌合体的研究中发现了SLC45A3-ELK4,该嵌合RNA经过相关实验论证认为其不是DNA层面的行为,而是RNA层面的行为,并对其为顺式剪接还是反式剪接行为进行了论证。研究倾向认为,该嵌合体RNA为read through之后的顺式剪接,意味着,融合基因的领域又多了一种存在形式,一种更加灵活的形式。目的:鉴定融合基因在前列腺癌组织与前列腺癌相关细胞系中是否真实存在,鉴定该融合基因可能拥有的亚型,鉴定该融合基因是否为DNA层面的行为。探索这种融合基因在前列腺癌细胞中的功能。探索该融合基因的作用机制;筛选前列腺癌与癌旁组织中表达差异显著的miRNA,探讨MiR-182-5P对前列腺癌增殖、凋亡、侵袭方面的影响。方法:1、在DU145、PC3、LNCa P、22RV1、C42前列腺相关细胞系中运用PCR单克隆化的方法检测TTTY15-USP9Y是否真实存在,鉴别其包含的不同亚型2、在DU145、PC3、LNCa P、RWPE、22RV1、C42前列腺相关细胞系中运用RT-PCR方法检测TTTY15-USP9Y的表达。3、在结肠癌细胞,肾细胞,及脐带间充质干细胞,肝癌细胞中以及DU145中进行融合基因TTTY15-USP9Y的检测4、Northern blot对TTTY15-USP9Y的鉴定6、构建优势表达细胞系DU145的纯系单克隆细胞株7、步移PCR对纯系单克隆细胞株中TTTY15-USP9Y的DNA层面及RNA层面进行鉴定。8、利用crispr/cas9技术对优势表达的细胞株进行DNA层面的双打靶,并对细胞进行单克隆化,挑选拼接准确的单克隆细胞系,人工构建具有TTTY15-USP9Y融合基因的细胞株。9、对人工构建后的细胞株进行DNA层面及RNA层面的鉴定,进一步帮助确认融合基因发生的层面。10、对新的TTTY15-USP9Y的序列进行功能域的预测11、运用免疫荧光Western Blot检测编码蛋白12、对原始的母基因TTTY15,及USP9Y在融合位点之前与之后进行干扰,检测干扰效率13、运用划痕实验,EDU实验,周期检测,凋亡检测等方法探讨融合基因的功能14、将原始的USP9Y的5’UTR区与融合后的新的5’UTR区进行比较15、将原始的USP9Y的启动子与新的融合基因的启动子进行功能比较研究结果:1、在前列腺癌的相关细胞系中进行融合基因表达量的鉴定,确认优势亚型为TTTY15-USP9Y-480,并确认优势表达的细胞为DU145。2、在肠癌细胞,肾细胞,及脐带间充质干细胞,肝癌细胞中以及DU145中进行融合基因TTTY15-USP9Y的检测发现,TTTY15-USP9Y-480在前列腺癌细胞中表达量最高。3、建立单克隆细胞株-前列腺癌细胞系DU145,通过对短期内建系的单克隆细胞株进行DNA层面及RNA层面的鉴定,确认TTTY15-USP9Y的融合不是DNA层面的行为,为RNA层面的嵌合。4、利用crispr/cas9技术对前列腺癌细胞进行DNA层面的双打靶,成功构建,并挑选出TTTY15与USP9Y准确对接的单克隆细胞株,人工的构建了TTTY15-USP9Y融合基因的纯系细胞系。5、通过对人工构建的融合基因细胞系进行RNA及DNA层面的鉴定,进一步印证,融合基因的发生确实具有RNA层面精确的剪接方式及偏好,并进一步提示出融合基因的发生是RNA层面的顺式剪接。6、根据新的融合基因的序列进行功能区的预测,结果显示功能区没有发生改变,原始的蛋白编码区没有被破坏。7、免疫荧光试验及Western Blot实验结果显示,USP9Y蛋白在DU145细胞株中表达量最高,主要集中在胞质中。8、对原始母基因融合位点前后的干扰差异,相关功能实验证实,融合基因具有促进前列腺癌细胞增值的能力,可以促使前列腺癌细胞加速进入G2期。促进前列腺癌细胞的迁移能力,侵袭能力。9、原始的USP9Y的5’UTR区与融合后的新的5’UTR区进行比较,有一定的差异,但是没有达到具有统计学意义的差距。10、原始的USP9Y的启动子与新的融合基因的启动子进行功能比较,差异显著,具有统计学意义。融合后的TTTY15-USP9Y的启动子区明显强于原USP9Y的启动子。结论:中国人前列腺癌组织中确实存在TTTY15-USP9Y的融合,其在前列腺癌细胞系中也存在。TTTY15-USP9Y基因融合共有四个亚型,无论是在中国人的前列腺癌组织中,还是在西方人组织建株的前列腺细胞系中,都是以TTTY15-USP9Y-480为优势亚型。根据相关实验证实,TTTY15-USP9Y融合基因为RNA层面的行为。本课题通过一系列的实验证实,融合基因强烈上调了USP9Y的表达,进一步促进了前列腺癌细胞的增值及相关肿瘤特征。并进一步探索出,融合基因的新启动子区在此过过程中发挥了重要作用。根据前列腺癌组织的测序信息,设计引物在前列腺癌细胞系中进行pcr之后单克隆化,鉴定出TTTY15-USP9Y的融合确实存在,并且含有四个亚型。研究背景:miRNA通过多种方式参与调控细胞的发育、增殖、凋亡及应激反应,对细胞自身稳定和发育起着重要作用,miRNA的表达异常是恶性肿瘤的一个重要特征。相较于其他领域,前列腺相关的miRNA的研究起步是较晚的。且研究的规模的较小,重复验证的较少。而一个理想的诊断标志物需要在大规模的样本筛查中表现稳定。目的:筛选前列腺癌与癌旁组织中表达差异显著的miRNA,探讨MiR-182-5P对前列腺癌增殖、凋亡、侵袭方面的影响。方法:1、在PC3、LNCa P、RWPE、DU145、22RV1、C42前列腺相关细胞系中运用RT-PCR方法检测MiR-182-5P的表达。合成MiR-182-5P的agomir,antagomir,agomir NC,antagomir NC用以进行miRNA的功能研究。通过clontech的miRNA特异转染试剂Xfect?siRNA Transfection Reagent,转染前列腺癌DU145,LNCa P细胞系,检测MiR-182-5P表达的变化。运用Edu试剂盒检测转染前后细胞增殖能力的变化;运用流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化;划痕实验检测细胞迁移能力的变化;Transwell检测细胞系侵袭能力的变化。从各个方面探讨MiR-182-5P在前列腺癌发生发展中的作用。2、利用生物信息学方法预测其启动子区是否存在ar结合位点,利用chip实验验证相关预测位点是否有AR的结合。利用DHT及mdv3100刺激雄激素受体阳性的细胞系观察MiR-182-5P的表达水平是否受AR变化的影响。运用RT-PCR方法检测MiR-182-5P与AR下游靶之间的关系。3、利用生物信息学方法即miRbase、star Base、Tarbase、target Scan等相关数据库预测MiR-182-5P可能的靶基因,把其与65对测序结果中,癌组织里下调的基因进行取交集。之后对筛选出的靶基因根据预测结果进行排序,优选了6个与肿瘤发生发展密切相关,并在肿瘤组织高通量测序中下调的靶基因。之后利用RT-PCR方法、Western Blot和双荧光素酶报告基因检测实验验证靶基因。并进一步探讨MiR-182-5P在前列腺癌中相关作用的机制。4、运用Western Blot,周期检测,凋亡水平检测,以及划痕实验检测182的补偿效果,以及ARRDC3,ITGb4对于MiR-182-5P的补偿能力。5、培养细胞,对细胞进行MiR-182-5P的过表达,选取10只5周龄的雄性裸鼠,进行皮下荷瘤实验。观察肿瘤的生成与生长速度的变化,并对肿瘤组织行Ki67的免疫组化实验。研究结果:1、通过组织RNA sequence测序,发现一批miRNA存在组间差异,后经统计学分析,发现MiR-182-5P差异倍数在5倍以上,组间差异较显著。后经realtime pcr实验验证,其在前列腺癌的表达量显著高于非癌组织。2、MiR-182-5P在du145中表达量较低,适合进行过表达的检测。过表达MiR-182-5P的处理组侵袭能力更强,抑制组侵袭能力有下降。3、MiR-182-5P表达水平的变化可影响AR下游靶。并存在于ar与下游靶之间的通路上。4、实验结果显示,转染MiR-182-5P agomir可明显抑制p MIR-REPORTARRDC3-3’UTR-Wt的荧光素酶活性。5、过表达MiR-182-5P对细胞周期,凋亡及迁移能力造成的影响可通过抑制ITGb4进行补偿,抑制MiR-182-5P对前列腺癌细胞造成的影响可通过干扰ARRDC3予以平衡。6、裸鼠体内荷瘤实验结果显示,过表达MiR-182-5P可明显促进肿瘤的形成和发展。结论:MiR-182-5P在癌与癌旁组织中表达差异明显。MiR-182-5P能够促进前列腺癌细胞的增殖、抑制前列腺癌细胞的早期凋亡,该miRNA对于前列腺癌细胞的侵袭能力具有重要作用。MiR-182-5P与AR相关,受到AR的调控。MiR-182-5P是通过直接与ARRDC3 3’UTR区结合,下调ARRDC3的表达,从而发挥促进前列腺癌细胞的增殖,侵袭的作用。MiR-182-5P的稳定表现有望作为新的临床诊断标志物及治疗干预的靶点。MiR-182-5P可直接作用于ARRDC3,MiR-182-5P可影响ARRDC3的相关结合蛋白。MiR-182-5P在体内也可明显促进肿瘤的形成与发展。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25

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