新型mTOR抑制剂Y31延缓大鼠多囊肾病进展的作用及机制研究

发布时间：2018-03-14 09:27

  本文选题：常染色体显性多囊肾病(ADPKD)　切入点：mTOR　出处：《第二军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：随着医疗检测水平和人们健康知识水平的不断提高,常染色体显性多囊肾病(Autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD),已经逐渐被人们所熟知。这种最常见的单基因遗传性肾病,其发病率之高,并发症之重,给患者家庭和整个社会造成了巨大的经济负担。ADPKD的发病率约为1/400-1/1000,其病理特点是双肾满布大小不等、充满囊液的液性囊泡,随着病程的进展、囊液的不断分泌和蓄积,囊泡不断增大,同时压迫临近的正常肾组织,最终导致肾脏结构和功能的不可逆损伤。据统计,ADPKD患者在60岁以后,约有一半以上的患者会进展到终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)。ADPKD目前尚无有效的治疗方法,病人进入ESRD后,主要的治疗措施为透析治疗包括血液透析,腹膜透析和肾脏移植治疗。目前认为ADPKD的致病基因主要包括两个即多囊肾病基因1(Polycystic kidney disease 1 gene,PKD1)和多囊肾病基因2(Polycystic kidney disease 2 gene,PKD2)。PKD1和PKD2编码的蛋白分别为多囊蛋白l(polycystin-l,PCl)和多囊蛋白2(polycystin-2,PC2),PCl和PC2在胞内侧通过C末端相互作用构成复合体,起到阳离子通道作用,通过感受机械压力等各种刺激,从而调节细胞钙离子的内流,传递细胞信号。但是近几年在临床发现部分有ADPKD临床表现的患者,却没有发现以上两个基因位点的突变,提示我们可能存在pdk1和pkd2之外的致病基因。ADPKD的发病机制目前尚不明确,近年来研究发现的致病机制包括有哺乳动物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号转导通路过度上调,血管加压素V2受体介导的环磷酸腺苷(cAMP)异常激活效应,纤毛机械-钙离子内流障碍,补体旁路的过度激活以及酪氨酸激酶(Janus Kinase,JAK)—转录激活因子-3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路的异常活化等。目前对于ADPKD的治疗药物研究主要是针对以上的研究机制,但是仍然没有一个治疗效果确切并且副作用又小的特效药物,因此继续探索和研发治疗ADPKD的有效药物仍是一个急需解决的医学问题。因此本研究采用了新型mTOR抑制剂Y31来研究其对Han:SPRD多囊肾病大鼠的治疗作用及可能作用机制。Y31由长征医院肾内科与中国科学院药物研究所共同研发。前期研究发现其药代动力学与水溶性等特性要明显优于Rapamycin,有可能成为新的治疗ADPKD的有效药物。mTOR抑制剂对于mTOR的抑制作用已经明确,而mTOR对于JAK-STAT1/3的调节作用已经有越来越多的研究,而本科室前期的研究表明,JAK-STAT1/3对于补体B因子(CFB)有正向调控作用,而CFB通过活化巨噬细胞等作用促进多囊肾病的发生发展也已经被证实,因此我们考虑mtor抑制剂可能会通过jak-stat1/3这一途径影响补体b因子的表达,进而干预多囊肾病的疾病进程,所以在本研究还会观察mtor抑制剂对于补体系统的影响。传统mtor抑制剂在临床试验中未能取得令人满意的效果,考虑其原因一方面为,相比动物实验用药,患者口服药物剂量较小,另一方面的原因可能为mtor被抑制后,其负反馈通路pi3k-akt通路被激活,最终导致mtor抑制不完全,治疗效果不理想,此外传统rapamycin水溶性差导致肾脏局部药物浓度偏低也可能是重要原因之一。因此本研究拟通过联合用药,多靶点治疗,实现对多囊肾病大鼠的有效治疗。二甲双胍(metformin),是目前治疗2型糖尿病的一线降糖药物,它是目前公认的amp依赖的蛋白激酶(ampk)激动剂,ampk活化后,可以通过直接或间接方式抑制mtor,此外它还可以通过激活具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸梅活性的双重特异性磷酸酶pten来抑制pi3k-akt通路的激活,进而抑制mtor的活化。因此本研究拟通过新型mtor抑制剂y31与metformin的联合用药来实现多靶点治疗。由于metformin自身有mtor抑制作用,因此联合用药可以减少mtor抑制剂的使用剂量,进而可以减少mtor抑制剂所带来的感染等并发症,同时metformin具有激活pten进而抑制pi3k-akt通路的作用,可以降低甚至阻断抑制mtor后所导致的负反馈通路激活。这样联合用药治疗多囊肾病的模式在adpkd研究中尚属首次,旨在通过本研究,为临床治疗adpkd探索新的治疗物药及治疗模式。研究方法采用多囊肾病动物模型han:sprd多囊肾病大鼠和人肾囊肿衬里上皮细胞wt9-12细胞系,通过灌胃等给药方式给药,内眦及心脏取血等方法取血检测肾功能指标,来评价药物的治疗作用;使用westernbloting,组织病理切片染色,mtt等实验方法,检测药物对大鼠肾脏组织以及wt9-12细胞中mtor通路相关蛋白p-p70s6k及mtor负反馈调节通路中关键蛋白分子p-akt表达量的变化,检测补体旁路途径相关蛋白补体b因子(cfb)及补体c3降解片段表达量的变化,观察药物对大鼠肾脏囊肿生长及细胞增殖的影响等以探讨药物的作用机制。研究结果在第一部分动物实验中,与多囊肾病对照组(ctrl)相比,阳性对照药物rapa(1mg/kg)以及治疗药物y31(0.5mg/kg和2mg/kg)均可以显著降低han:sprd多囊肾病大鼠的双肾重体重比、囊肿指数指标以及血肌酐和尿素氮,实验终点发现给予y312mg/kg组体重下降比较明显,与ctrl组相比有统计学差异。在第二部分动物实验中,与多囊肾病对照组(ctrl)相比,阳性对照药物rapa(0.5mg/kg和1mg/kg)以及治疗药物metformin(150mg/kg)和y31(0.5mg/kg和2mg/kg)均可以降低han:sprd多囊肾病大鼠的双肾重体重比以及血肌酐和尿素氮,实验终点发现给予y312mg/kg组体重下降比较明显,与ctrl组相比有统计学差异;与多囊肾病对照组(ctrl)相比,联合用药组均可以降低han:sprd多囊肾病大鼠的双肾重体重比以及血肌酐和尿素氮,实验终点发现met150mg/kg联合y312mg/kg组体重下降比较明显,与ctrl组相比有统计学差异;但是联合用药未出现药物的协同或者叠加效应,在肾功能血肌酐及尿素氮的保护方面,联合用药组明显优于相应的met单药,且肌酐和尿素氮的下降有统计学差异,但是与相应的mtor抑制剂组相比肌酐和尿素氮的下降没有统计学差异。在第三部分动物实验中,与多囊肾病对照组(ctrl)相比,metformin(250mg/kg)单药治疗,metformin与rapa联合用药治疗以及rapa(0.5mg/kg)单药治疗均可显著降低han:sprd多囊肾病大鼠的血肌酐和尿素氮,联合用药组的治疗效果要明显优于metformin单药,但是与rapa单药治疗组相比,相应肾功能的改善并没有统计学差异。westernblotting结果显示,y31(0.5mg/kg和2mg/kg)同rapa(1mg/kg)一样,可以显著降低han:sprd多囊肾病大鼠肾脏组织中mtor通路下游蛋白p-p70s6k的表达量;而y31(0.5mg/kg)及rapa(1mg/kg)可以一定程度的增加han:sprd多囊肾病大鼠肾脏组织中mtor负反馈调节通路中相关蛋白p-akt的表达量,但是y31(2mg/kg)却能显著降低p-akt的表达量。westernblotting方法结果显示,y31(0.5mg/kg和2mg/kg)及rapa(1mg/kg)可以显著降低han:sprd多囊肾病大鼠肾脏组织中补体旁路途径相关蛋白补体b因子(cfb)以及补体c3降解片段c3b和c3c的表达量。免疫组化检测显示y31(0.5mg/kg和2mg/kg)及rapa(1mg/kg)可以显著降低han:sprd多囊肾病大鼠肾脏组织切片中增殖细胞核抗原ki-67阳性细胞数量。mtt法检测提示,在人肾囊肿衬里上皮细胞wt9-12细胞中给予不同药物浓度的y31后,可以抑制wt9-12细胞的细胞增殖率,且在一定范围内呈线性关系。westernblotting方法结果显示,在人肾囊肿衬里上皮细胞wt9-12细胞中给予不同药物浓度的y31作用后,可显著减少wt9-12细胞中mtor通路下游蛋白p-p70s6k蛋白的表达量,并且高浓度的y31(50um)能显著降低wt9-12细胞p-akt的表达量。westernblotting方法结果显示,在人肾囊肿衬里上皮细胞wt9-12细胞中给予不同药物浓度的y31刺激后,可以显著减少wt9-12细胞中补体旁路途径相关蛋白补体B因子(CFB)及补体C3降解片段C3c的表达量。结论本研究首先在体内动物实验证实了新型mTOR抑制剂Y31同传统的mTOR抑制剂具有同样的抑制mTOR信号通路的作用,并且大剂量的Y31具有抑制mTOR负反馈调节通路中关键蛋白p-AKT表达的作用。首次提出了mTOR抑制剂对于补体系统的抑制从而缓解多囊肾病大鼠疾病进展的新作用。然而本研究发现,Metformin单药虽然具有延缓多囊肾病大鼠疾病进展的作用,但是与mTOR抑制剂联合用药后未出现联合使用药物的协同或者叠加作用。在体外细胞实验中,亦证明了新型mTOR抑制剂Y31对于mTOR信号通路的抑制作用,高浓度的Y31同样显示了对于p-AKT表达的抑制作用,在细胞实验中也再次验证了其对于补体系统的抑制作用。因此,通过体内和体外实验研究,证实了新型mTOR抑制剂Y31可以通过抑制mTOR信号通路及补体系统、大剂量的Y31尚可抑制mTOR负反馈通路中关键蛋白p-AKT的表达来延缓Han:SPRD大鼠多囊肾病的进展。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692.1

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