环指蛋白2调节前列腺癌细胞周期和凋亡的表观遗传学机制研究

发布时间：2018-03-17 01:32

  本文选题：前列腺癌　切入点：环指蛋白2　出处：《第四军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:组蛋白的翻译后修饰是表观遗传调控的重要内容,已被证实在肿瘤的发生和发展过程中扮演了重要的角色。环指蛋白2(ring finger protein 2,RNF2)是多梳蛋白抑制性复合物1(polycomb repressive complex 1,PRC1)的催化亚单位,可介导组蛋白H2A(histone 2A,H2A)的单泛素化修饰。研究表明,RNF2在多种肿瘤中呈特异性高表达,且具有促肿瘤效应。但是RNF2在前列腺癌(prostate cancer,PCa)中的研究还鲜有报导。在本研究中,我们首先通过对PCa组织和良性前列腺增生组织(benign prostatic hyperplasia,BPH)中RNF2的表达进行检测,以明确RNF2在PCa中的表达水平。随后,通过在PCa细胞系中特异性下调RNF2的表达,检测细胞周期、凋亡和细胞活力的变化,以明确RNF2在PCa中的生物学功能。进一步,我们通过寻找差异性表达基因,筛选、验证受RNF2调控的下游靶基因并探索其相关的分子机制。方法:1.利用免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)对含有PCa(n=81)和BPH(n=71)的组织芯片(tissue microarray,TMA)进行RNF2的染色并利用H-Score评分系统对RNF2的表达水平进行评分,对PCa组织和BPH组织中RNF2的表达进行差异性分析,并对PCa组织中RNF2的表达水平与肿瘤的Gleason评分进行相关性分析。2.设计并合成靶向RNF2的特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)(siRNF2#1和siRNF2#2)以及阴性对照siRNA(siNC)。将它们转染DU145和LNCaP细胞并利用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和蛋白电泳(western blot,WB)对下调效果分别在mRNA水平和蛋白水平进行验证。利用流式细胞术(flow cytometry,FCM)对各处理组细胞的凋亡和细胞周期进行检测。利用噻唑蓝比色法(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide assay,MTT assay)检测各处理组细胞的活力。3.设计并合成靶向RNF2的特异性短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)(shRNF2#1和shRNF2#2)及对照shRNA(shScr),构建带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的shRNA慢病毒表达载体。将慢病毒包装载体及shRNA表达载体共同转染293T细胞进行慢病毒的包装,所得慢病毒分别命名为shRNF2#1、shRNF2#2和shScr。所得慢病毒分别感染DU145和LNCaP细胞,荧光显微镜下观察感染效率。利用RT-qPCR和WB检测RNF2的下调效果,利用FCM和MTT检测各处理组细胞的周期、凋亡和细胞活力变化。4.将shRNF2#1、shRNF2#2和shScr感染后的DU145细胞进行扩大培养,以5×106个细胞分别接种于裸鼠背外侧近右侧大腿处,观察各处理组移植瘤的生长情况,绘制生长曲线。观察结束后对所有实验小鼠实施安乐死,对肿瘤组织进行固定、包埋和切片。利用IHC对各处理组肿瘤组织中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和活化型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3,cleaved-casp3)进行染色,以评价细胞的增殖和凋亡情况。5.siRNF2#1、siRNF2#2和siNC分别转染DU145细胞,72小时后提取各处理组细胞总RNA并送上海伯豪生物技术公司进行数字基因表达谱检测,寻找RNF2下调组细胞与正常对照组细胞的差异性表达基因,并利用GeneOntology、BioCarta-ATCG等在线数据库对差异性表达基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析。利用RT-qPCR和WB进行验证,寻找RNF2的潜在功能性下游靶基因。对方法4中所得各处理组移植瘤组织进行RNF2和相应靶基因的IHC染色,验证二者的相关性。6.针对前期实验筛选出的RNF2潜在下游靶基因硫氧还蛋白结合蛋白基因(thioredoxin interacting protein,TXNIP)设计合成特异性siRNA和shRNA,构建shRNA的慢病毒表达载体并进行慢病毒包装,分别命名为siTXNIP和shTXNIP。利用siTXNIP和shTXNIP对RNF2下调细胞进行功能学挽救实验。siRNA实验分组为:siRNF2#1、siTXNIP、si RNF2#1+siTXNIP和siNC;shRNA实验分组为:shRNF2#1、shTXNIP、shRNF2#1+shTXNIP和shScr。利用RT-qPCR和WB检测各处理组细胞RNF2和TXNIP的表达水平,利用FCM和MTT检测细胞的周期、凋亡和细胞活力的变化。7.针对TXINP基因启动子区设计特异性PCR引物,利用染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)检测TXNIP启动子区RNF2的富集和组蛋白H2AK119Ub的水平。利用siRNA特异性下调RNF2的表达后,检测RNF2和H2AK119Ub在TXNIP启动子区的富集和水平变化。结果:1.对TMA的IHC染色和H-Score评分结果显示,PCa组织中RNF2的表达水平(H-Score:117.53±62.34)明显高于BPH组织(H-Score:90.14±63.66)。PCa组织中,RNF2的表达水平与Gleason评分的相关性分析结果显示,Gleason评分高(Gleason评分7)的PCa组织中RNF2的表达水平(H-Score:150.50±62.03)明显高于Gleason评分低(Gleason评分≤6)的PCa组织(H-Score:97.10±53.63)。2.RT-qPCR和WB结果显示,siRNF2#1和siRNF2#2均能在mRNA水平和蛋白水平有效下调RNF2的表达。FCM检测结果显示,与对照组细胞相对,RNF2下调组DU145和LNCaP的G1期细胞和凋亡细胞显著增加。MTT结果提示,RNF2下调组细胞的活力较正常对照组显著降低。3.成功包装能特异性下调RNF2的慢病毒颗粒并能有效感染目的细胞。RT-qPCR和WB结果显示,shRNF2#1和shRNF2#2均能在mRNA水平和蛋白水平有效下调RNF2的表达。细胞功能学实验结果显示,shRNF2#1和shRNF2#2可诱导DU145和LNCaP细胞的G1期阻滞、凋亡增加和细胞活力下降。4.成功建立了shScr、shRNF2#1和shRNF2#2慢病毒感染后的DU145细胞裸鼠移植瘤模型。结果显示,shScr、shRNF2#1和shRNF2#2处理组移植瘤在观察终点的体积分别为846.80±55.29 mm3、304.33±63.72 mm3和331.93±84.42 mm3。肿瘤生长曲线结果显示,实验组移植瘤的生长速度显著低于对照组。IHC染色结果显示,与shScr处理组相比,shRNF2#1和shRNF2#2处理组肿瘤组织中PCNA的表达水平明显降低,而cleaved-casp3的水平显著增加。5.对数字基因表达谱结果的分析显示,特异性下调RNF2所导致的≥1.5倍的差异化表达基因达632个,其中144个基因表达上调。利用Gene Ontlogy和BioCarta-TCGA等数据库的GO分析结果显示,大量差异性表达基因参与细胞周期、有丝分裂、增殖和凋亡等生物学行为的调控。基于PcGs的转录抑制功能考虑,我们重点对表达显著上调的基因进行了分析、筛选并利用RT-qPCR和WB进行验证。结果显示,与细胞增殖、凋亡和周期调控密切相关的TXNIP是RNF2潜在的重要功能性下游靶基因。对DU145细胞裸鼠移植瘤组织的IHC染色结果显示,RNF2下调组的肿瘤组织中TXNIP的表达水平显著高于对照组肿瘤组织。6.RT-qPCR和WB结果显示,siTXNIP和shTXNIP均能有效下调TXNIP的mRNA水平和蛋白水平。FCM结果显示,通过siRNA或shRNA同时下调RNF2和TXNIP可有效挽救单独下调RNF2所导致的DU145和LNCaP细胞凋亡增加和G1期阻滞。MTT实验结果显示,同时下调RNF2和TXNIP可有效挽救单独下调RNF2所导致的DU145和LNCaP细胞活力降低。7.Ch IP实验结果显示,RNF2可直接结合于TXNIP的启动子区并促进组蛋白H2AK119的单泛素化。利用siRNA特异性下调RNF2的表达后,RNF2的富集和H2AK119Ub的水平均显著降低。结论:1.RNF2在PCa中的表达水平显著高于BPH,且其表达水平与肿瘤的Gleason评分呈正相关,RNF2在PCa的发生发展过程中具有促肿瘤效应。2.RNF2对PCa细胞的周期、凋亡和细胞活力有重要的调控作用,下调RNF2可诱导PCa细胞发生周期阻滞,凋亡增加和细胞活力下降,并可显著抑制PCa裸鼠移植瘤的生长。3.RNF2下调可诱导大量下游靶基因的表达变化,其中TXNIP是其中一种功能性下游靶基因,RNF2的生物学功能部分依赖于它对TXNIP的表达调控。4.RNF2可直接结合于TXNIP的启动子区,并促进组蛋白H2AK119的单泛素化从而调控TNXIP的转录。5.RNF2是PCa潜在的生物标志分子和治疗靶点。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.25
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本文编号：1622586