功能性生物支架材料诱导尿道组织再生的实验研究

发布时间：2018-03-18 15:52

  本文选题：尿道重建　切入点：血管内皮细胞生长因子　出处：《第三军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景尿道缺损是常见的泌尿系统疾病,以外科手术重建缺损尿道是其有效的治疗手段,复杂性尿道缺损的重建是泌尿外科最具挑战性的手术之一。获取适宜的尿道重建替代材料是提高手术效果的关键环节,临床上通常采用自体组织重建缺损尿道,面临材料来源不足,术后并发症发生率高等问题,制备适宜的功能性生物材料有望解决这些自体组织无法克服的问题,成为尿道重建替代材料的可靠来源。尿道富含血管组织,丰富的血供对保持尿道正常形态和功能,促进损伤修复及组织再生都有着重要意义,VEGF作为特异性的血管内皮细胞有丝分裂原,在促进尿道组织再生中有着重要的应用价值。在以VEGF作为生物活性因子制备功能性材料的研究中,如何有效的将因子与材料相结合,建立因子的靶向结合-释放系统,在重建局部形成持续有效的生长因子微环境,更好的促进组织再生是目前急需解决的问题。胶原结合域(CBD)能够特异性的结合于胶原蛋白,利用基因工程的方法将CBD偶联于VEGF,能够介导VEGF与胶原蛋白特异性结合。在此基础上,构建以胶原材料为基质,以CBD-VEGF为生物活性因子的功能性支架材料,既可以发挥材料的三维支持作用,又能够为组织再生提供持续有效的生物活性信号,以这种功能性生物材料重建尿道缺损将有利于尿道重建术后的尿道组织再生与功能恢复。材料与方法1.NAT-VEGF及CBD-VEGF重组蛋白的表达、纯化及鉴定。以载体pET28a及大肠杆菌BL21(DE3)构建NAT-VEGF和CBD-VEGF原核表达系统。重组质粒pET28a-VEGF及pET28a-CBD-VEGF转化大肠杆菌,以IPTG诱导蛋白表达,Ni纯化柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE电泳对重组蛋白NAT-VEGF及CBD-VEGF进行鉴定。2.NAT-VEGF及CBD-VEGF重组蛋白与胶原蛋白的结合能力检测。以ELISA法检测NAT-VEGF、CBD-VEGF重组蛋白与胶原蛋白的结合能力,不同浓度的重组蛋白(0、0.094μM、0.1875μM、0.375μM、0.75μM、1.5μM、3μM、6μM),加入铺有等体积Ⅰ型胶原蛋白的酶标板,结合2小时后以pbs洗去未结合的重组蛋白,依次加入anti-vegfantibody、anti-rabbitigg,显色后以酶标仪测定405nm处吸光值,用以比较两种重组蛋白与Ⅰ型胶原蛋白的结合力。3.nat-vegf及cbd-vegf重组蛋白在胶原蛋白材料上释放特征检测将等量的nat-vegf或cbd-vegf滴加于铺有等体积Ⅰ型胶原蛋白的酶标板,结合2小时后每孔加入500μlpbs,此后每隔12小时每孔吸除400μlpbs,更换为400μl新鲜的pbs。结合完成时以及此后每24小时以酶标仪测定405nm处吸光值,评价胶原蛋白膜上留存的重组蛋白含量,以结合完成时为100%,计算每个时间节点上胶原蛋白膜上留存的因子量的百分比,用以评价nat-vegf及cbd-vegf重组蛋白在胶原材料上的释放特征。4.nat-vegf及cbd-vegf重组蛋白的生物活性检测。以商业化的vegf(rhvegf)为对照,评价非胶原结合状态及胶原结合状态下nat-vegf、cbd-vegf促进人脐静脉内皮细胞增殖的活性。人脐静脉内皮细胞常规培养8小时后分别加入干预因素nat-vegf、cbd-vegf及rhvegf,终浓度为0、0.094μm、0.1875μm、0.375μm、0.75μm、1.5μm、3μm、6μm,每组6孔,并继续培养3天,以mmt法测定细胞增殖情况,用于评价nat-vegf、cbd-vegf重组蛋白的生物活性。5.cbd-vegf修饰的胶原支架材料在比格犬尿道缺损重建中的作用。将15只成年雄性比格犬随机分为三组:collagen组、collagen-cbd-vegf组、mscs组,每组5只。于阴茎骨与球部尿道之间完整切除5cm长的尿道海绵体,建立犬尿道缺损模型。分别以单纯胶原支架材料、cbd-vegf修饰的胶原支架材料,负载mscs的胶原支架材料重建尿道缺损。通过比格犬术后排尿情况、尿动力学检查、尿道造影等评价重建尿道功能及形态。术后半年,收集重建尿道标本,以he染色、masson染色、免疫荧光检测评价重建尿道的组织再生、基质代谢等情况。主要结果1.利用基因工程技术成功的表达nat-vegf及cbd-vegf重组蛋白。nat-vegf及cbd-vegf重组蛋白单体大小分别为18kda、20kda。2.ni纯化柱能够完成对重组蛋白的纯化,纯化后的cbd-vegf重组蛋白能够特异性结合于胶原蛋白,并在胶原蛋白材料上平稳释放。3.非胶原结合状态下cbd-vegf具有与nat-vegf、rhvegf相似的生物活性,在胶原结合状态下cbd-vegf的生物活性显著高于nat-vegf及rhvegf,能够更好的促进脐静脉内皮细胞增殖。4.CBD-VEGF与MSCs均能够显著促进尿道上皮组织再生,促使重建尿道形成近似于正常尿道的上皮层。CBD-VEGF与MSCs均能够促进平滑肌组织再生,但重建尿道内的平滑肌组织无法达到正常尿道水平,且再生的平滑肌走行杂乱、无规律。CBD-VEGF能够更好的促进血管组织再生,促使部分新生血管形成形态类似于正常尿道海绵体的血窦样结构。此外,CBD-VEGF能够减少细胞外基质中胶原蛋白沉积,有利于减轻重建尿道的挛缩。5.CBD-VEGF和MSCs均能改善比格犬尿道重建术后排尿状态,尿道造影显示二者尿道直径无显著差异,CBD-VEGF组的重建尿道的平均尿道压力低于MSCs组。结论利用载体pET28a及大肠杆菌BL21(DE3),能够成功表达NAT-VEGF、CBD-VEGF重组蛋白。非胶原结合状态下CBD-VEGF与NAT-VEGF、rhVEGF具有相似的生物活性,胶原结合状态下CBD-VEGF的生物活性高于NAT-VEGF、rhVEGF。相较于NAT-VEGF,CBD-VEGF能够特异性结合于胶原蛋白,平稳释放,可以建立VEGF特异性的靶向结合-释放系统。在比格犬长段尿道缺损重建模型中CBD-VEGF能够促进尿道组织再生,改善重建尿道功能,其效果达到并部分超过MSCs。Collagen-CBD-VEGF可以成为制备功能性尿道支架的候选材料。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R699;R318.08

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