凋亡诱导因子在肾癌中表达下调的机制及其功能研究

发布时间：2018-03-24 05:43

  本文选题：肾癌　切入点：凋亡诱导因子(AIF)　出处：《哈尔滨工业大学》2014年博士论文

【摘要】：肾癌是威胁人类健康的恶性肿瘤之一,近年来我国肾癌发病率、死亡率呈现逐年增长的趋势,在发达地区表现的尤为明显。由于肾癌对放化疗不敏感,因此对肾癌的治疗通常采用手术直接切除的办法。目前约30%的肾癌患者在确诊时已经发生了癌症的转移,进入肾癌的晚期,错过了手术治疗的最佳时期。早期肾癌患者的五年存活率约96%,而晚期肾癌患者的五年存活率仅约20%。目前对肾癌分子生物学机制的研究认为VHL(Von Hippel-Lindau)基因功能异常是肾癌发生的关键步骤,但同时也发现VHL基因功能异常并不直接造成肾癌发生,提示在肾癌发生过程中存在其它重要的分子事件。凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于X染色体的重要基因,目前认为AIF具有双重功能:在正常细胞生理活动中通过NADH氧化还原酶活性清除氧自由基,维持氧化呼吸链的完整并促进细胞内能量转换;在细胞受到凋亡信号刺激时自线粒体释放进入细胞核,依赖其DNA结合能力,与相互作用蛋白形成复合物降解核酸,促进细胞程序性死亡。本文在实验室前期工作基础上,探讨了AIF在肾癌中的表达情况、分子机制、相互作用分子以及对肾癌细胞增殖和凋亡的影响,以期为肾癌分子机制和肾癌治疗的研究提供新的线索。在研究过程中,首先利用多种实验技术证明了AIF在肾癌中的表达下调具有显著性和频发性。在基于Northern Blot原理的癌症表达谱阵列分析实验中,以AIF c DNA为探针检测19种组织类型的154对癌和癌旁样品中AIF m RNA的表达水平,发现AIF在正常肾组织中表达最高,而在肾癌组织中具有显著的表达下调,在其它类型的癌症中未见AIF如此明显的表达差异;利用免疫印迹实验检测肾透明细胞癌及癌旁样品,发现85%(17/20)的肾透明细胞癌样品中存在AIF表达水平的显著下调;在免疫组化实验中,84%(43/51)的肾癌组织中呈现AIF表达的显著性下调,而在癌旁组织样品中具有高水平AIF表达,并集中分布于近曲小管。这一系列实验结果充分说明AIF在肾癌中的表达下调具有显著性和普遍性。根据AIF在正常肾组织近曲小管中高表达但在肾癌组织中表达下调的现象,并结合肾癌起源于肾小管上皮细胞恶性转化的事实,提示AIF与肾癌发生有着重要的联系。在进一步探讨AIF在肾癌中表达下调的机制时发现,其分子机制分为遗传学和表观遗传学两个层面。在一组确定了AIF表达下调的肾癌组织样品中,采用Southern Blot杂交检测AIF在癌症和癌旁组织基因组中的突变,发现在11对样品中有3例的肾癌组织基因组存在AIF 3′-UTR部分缺失;采用荧光原位杂交检测另外11对AIF低表达肾癌临床样本,发现有2例存在AIF缺失。在AIF启动子区DNA甲基化分析实验中,在4例无AIF基因缺失,同时AIF表达下调的男性肾癌病例中,发现癌症组织中AIF启动子区均有一定程度的甲基化,其甲基化类型包括少量Cp G甲基化和大量非Cp G甲基化,而癌旁组织中未发现此类现象;对肾癌细胞系Caki-1的检测同样发现其转录起始位点下游存在一个频发的Cp T甲基化位点;在Caki-1细胞培养基中加入DNA甲基化酶抑制剂可以提高Caki-1细胞中AIF的表达水平。上述结果说明AIF在肾癌中的表达抑制的机制包括AIF基因水平的缺失和AIF启动子区DNA异常甲基化。AIF在肾癌细胞中的功能不但与其表达水平相关,还与其在肾癌细胞特定状态下的相互作用因子具有直接的关系。在本研究中通过GST pull-down实验发现了若干AIF在肾癌细胞中的潜在相互作用蛋白,并利用免疫共沉淀实验确认了其中AIF与STK3的相互作用。STK3是Hippo信号通路中的核心蛋白,也与FOXO和RASSF1A具有相互作用,能够调节细胞的增殖和凋亡。为了解AIF在肾癌发生和发展中的作用,本研究在肾癌细胞中过表达AIF,发现STK3蛋白的磷酸化水平伴随AIF的表达逐渐升高,而细胞内总体STK3的表达水平基本维持不变;AIF过表达的肾癌细胞在转染后24小时内大量死亡;在AIF的亚细胞定位分析中发现,过表达AIF的凋亡肾癌细胞中发生了AIF核转位。这些实验结果说明了AIF在肾细胞中功能的复杂性,尽管AIF在正常肾组织中高表达,但在肾癌细胞中高表达的AIF足以诱导细胞的程序性死亡,这一过程涉及AIF和多个细胞信号通路相互作用,以上事实为AIF的功能研究和肾癌的治疗提供了新的实验依据。综上所述,通过以上对AIF在肾癌中的表达下调和机制的分析,AIF的相互作用蛋白及在肾癌中的功能研究,表明AIF在肾组织中的表达和功能具有特异性,在肾癌发生发展过程中可能起着重要作用。对AIF的深入研究有助于探讨肾癌恶性演进过程的机制,为肾癌的治疗提供潜在的靶点。
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【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R737.11
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本文编号：1656976